Approcci di visualizzazione e analisi tridimensionali e quadridimensionali per studiare l'allungamento e la segmentazione assiale dei vertebrati
Summary
Qui descriviamo strumenti e metodi computazionali che consentono la visualizzazione e l’analisi di dati di immagini tridimensionali e quadridimensionali di embrioni di topo nel contesto dell’allungamento e della segmentazione assiale, ottenuti mediante tomografia a proiezione ottica in toto e mediante imaging dal vivo e colorazione a immunofluorescenza a montaggio intero utilizzando la microscopia multifotonica.
Abstract
La somitogenesi è un segno distintivo dello sviluppo embrionale dei vertebrati. Per anni, i ricercatori hanno studiato questo processo in una varietà di organismi utilizzando una vasta gamma di tecniche che comprendono approcci ex vivo e in vitro. Tuttavia, la maggior parte degli studi si basa ancora sull’analisi dei dati di imaging bidimensionali (2D), che limita la corretta valutazione di un processo di sviluppo come l’estensione assiale e la somitogenesi che coinvolgono interazioni altamente dinamiche in uno spazio 3D complesso. Qui descriviamo le tecniche che consentono l’acquisizione di immagini dal vivo del topo, l’elaborazione di set di dati, la visualizzazione e l’analisi in 3D e 4D per studiare le cellule (ad esempio, progenitori neuromesodermici) coinvolte in questi processi di sviluppo. Forniamo anche un protocollo passo-passo per la tomografia a proiezione ottica e la microscopia a immunofluorescenza a montaggio intero in embrioni di topo (dalla preparazione del campione all’acquisizione di immagini) e mostriamo una pipeline che abbiamo sviluppato per elaborare e visualizzare i dati delle immagini 3D. Estendiamo l’uso di alcune di queste tecniche ed evidenziamo caratteristiche specifiche di diversi software disponibili (ad esempio, Fiji / ImageJ, Drishti, Amira e Imaris) che possono essere utilizzate per migliorare la nostra attuale comprensione dell’estensione assiale e della formazione di somiti (ad esempio, ricostruzioni 3D). Complessivamente, le tecniche qui descritte sottolineano l’importanza della visualizzazione e dell’analisi dei dati 3D nella biologia dello sviluppo e potrebbero aiutare altri ricercatori ad affrontare meglio i dati delle immagini 3D e 4D nel contesto dell’estensione e della segmentazione assiale dei vertebrati. Infine, il lavoro impiega anche nuovi strumenti per facilitare l’insegnamento dello sviluppo embrionale dei vertebrati.
Introduction
La formazione dell’asse del corpo dei vertebrati è un processo altamente complesso e dinamico che si verifica durante lo sviluppo embrionale. Alla fine della gastrulazione [nel topo, intorno al giorno embrionale (E) 8.0], un gruppo di cellule progenitrici epiblastiche note come progenitori neuromesodermici (NMP) diventa un fattore chiave dell’estensione assiale in una sequenza testa a coda, generando il tubo neurale e i tessuti mesodermici paraassiali durante la formazione del collo, del tronco e della coda 1,2,3,4 . È interessante notare che la posizione che questi NMP occupano nell’epiblasto caudale sembra svolgere un ruolo chiave nella decisione di differenziarsi in mesoderma o neuroectoderma5. Sebbene attualmente non ci sia un’impronta molecolare precisa per le NMP, queste cellule sono generalmente ritenute co-espressive T (Brachyury) e Sox2 5,6. I meccanismi esatti che regolano le decisioni sul destino dell’NMP (cioè se prendono vie neurali o mesodermiche) stanno solo iniziando a essere definiti con precisione. L’espressione di Tbx6 nella regione della striscia primitiva è un marcatore precoce della decisione del destino NMP, poiché questo gene è coinvolto nell’induzione e nella specificazione del mesoderma 6,7. È interessante notare che le prime cellule del mesoderma sembrano esprimere alti livelli di Epha18 e la segnalazione Wnt / β-catenina, così come Msgn1 hanno anche dimostrato di svolgere ruoli importanti nella differenziazione del mesoderma paraassiale e nella formazione di somiti 9,10. Un’analisi spazio-temporale completa delle NMP a livello di singola cellula sarà certamente strumentale per comprendere appieno i meccanismi molecolari che controllano la specifica del mesoderma.
La formazione di somiti (precursori delle vertebre) è una caratteristica chiave dei vertebrati. Durante l’allungamento assiale, il mesoderma paraassiale viene segmentato in una serie di unità ripetute bilaterali note come somiti. Il numero di somiti e il tempo necessario per la formazione di nuovi segmenti varia tra le specie11,12. La somitogenesi comporta oscillazioni periodiche di segnalazione (note come “orologio di segmentazione”) che possono essere osservate dall’espressione ciclica di diversi geni delle vie di segnalazione Notch, Wnt e Fgf nel mesoderma presomitico (ad esempio, Lfng)11,12. L’attuale modello di somitogenesi postula anche l’esistenza di un “fronte d’onda di maturazione”, una serie di complessi gradienti di segnalazione che coinvolgono la segnalazione di Fgf, Wnt e acido retinoico che definiscono la posizione del bordo posteriore di ogni nuovo somite. Un’interazione coordinata tra il “segmentation clock” e il “fronte d’onda di maturazione” è quindi fondamentale per la generazione di questi moduli precursori delle vertebre in quanto le perturbazioni in questi processi morfogenetici chiave possono provocare letalità embrionale o la formazione di malformazioni congenite (ad esempio, scoliosi)13,14,15.
Nonostante i recenti progressi sostanziali nelle tecniche di imaging, nei metodi di analisi delle bioimmagini e nel software, la maggior parte degli studi sull’allungamento assiale e sulla somitogenesi si basano ancora su dati di immagini bidimensionali singole / isolate (ad esempio, sezioni), che non consentono una visualizzazione completa del tessuto multidimensionale e complicano una chiara differenziazione tra malformazioni patologiche (cioè dovute a mutazioni) rispetto alla normale variazione morfologica che si verifica durante lo sviluppo embrionale16 . L’imaging in 3D ha già scoperto nuovi movimenti morfogenetici, precedentemente non identificati con i metodi 2D standard 17,18,19,20, evidenziando il potere dell’imaging in toto per comprendere i meccanismi della somitogenesi dei vertebrati e dell’estensione assiale.
La microscopia 3D e 4D di embrioni di topo, in particolare l’imaging dal vivo, è tecnicamente impegnativa e richiede passaggi critici durante la preparazione del campione, l’acquisizione delle immagini e la pre-elaborazione dei dati al fine di consentire un’analisi spazio-temporale accurata e significativa. Qui, descriviamo un protocollo dettagliato per l’imaging dal vivo e la colorazione dell’immunofluorescenza a montaggio intero degli embrioni di topo, che può essere utilizzato per studiare sia le NMP che le cellule mesodermiche durante l’estensione e la segmentazione assiale. Inoltre, descriviamo anche un protocollo per la tomografia a proiezione ottica (OPT) di embrioni e feti più anziani, che consente la visualizzazione 3D in toto e la quantificazione di anomalie patologiche che possono derivare da problemi durante la somitogenesi (ad esempio, fusione ossea e scoliosi)13,21,22. Infine, illustriamo la potenza delle ricostruzioni di imaging 3D nello studio e nell’insegnamento della segmentazione dei vertebrati e dell’allungamento assiale.
Protocol
Representative Results
Discussion
L’allungamento assiale e la segmentazione sono due dei processi più complessi e dinamici che si verificano durante lo sviluppo embrionale dei vertebrati. L’uso dell’imaging 3D e 4D con tracciamento monocellulare è stato applicato, da tempo, per studiare questi processi sia negli embrioni di zebrafish che di pollo, per i quali l’accessibilità e le condizioni di coltura facilitano l’imaging complesso 19,44,45,46,47,48,49</…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Vorremmo ringraziare Olivier Pourquié e Alexander Aulehla per il ceppo reporter LuVeLu, il laboratorio SunJin per il campione di test RapiClear, Hugo Pereira per l’aiuto con BigStitcher, Nuno Granjeiro per aver contribuito a configurare l’apparato di imaging dal vivo, la struttura per animali IGC e i membri passati e presenti del laboratorio Mallo per commenti utili e supporto nel corso di questo lavoro.
Ringraziamo il supporto tecnico dell’Advanced Imaging Facility di IGC, che è supportato dal finanziamento portoghese ref# PPBI-POCI-01-0145-FEDER-022122 e ref# PTDC/BII-BTI/32375/2017, cofinanziato dal Programma operativo regionale di Lisbona (Lisboa 2020), nell’ambito dell’accordo di partenariato Portogallo 2020, attraverso il Fondo europeo di sviluppo regionale (FEDER) e Fundação para a Ciência e a Tecnologia (FCT, Portogallo). Il lavoro descritto in questo manoscritto è stato supportato dalle sovvenzioni LISBOA-01-0145-FEDER-030254 (FCT, Portogallo) e SCML-MC-60-2014 (Santa Casa da Misericórdia, Portogallo) a M.M., l’infrastruttura di ricerca Congento, il progetto LISBOA-01-0145-FEDER-022170 e la borsa di dottorato PD / BD / 128426/2017 ad A.D.
Materials
| Agarose low gelling temperature | Sigma | A9414 | Used to mounting embryos (e.g. for OPT) |
| Amira software | Thermofisher | – | Commerial software tool |
| Anti-Brachyury (Goat polyclonal) | R and D Systems | AF2085 RRID:AB_2200235 | For immunofluorescence |
| Anti-Sox2 (Rabbit monoclonal) | Abcam | ab92494 RRID:AB_10585428 | For immunofluorescence |
| Anti-Tbx6 (Goat polyclonal) | R and D Systems | AF4744 RRID:AB_2200834 | For immunofluorescence |
| Anti-Laminin111 (Rabbit polyclonal) | Sigma | L9393 RRID:AB_477163 | For immunofluorescence |
| Anti-goat 488 (Donkey polyclonal) | Molecular Probes | A11055 RRID:AB_2534102 | For immunofluorescence |
| Anti-rabbit 568 (Donkey polyclonal) | ThermoFisher Scientific | A10042 RRID:AB_2534017 | For immunofluorescence |
| Benzyl Alcohol (99+%) | (any) | – | Used to clear embryos (component of BABB) |
| Benzyl Benzoate (99+%) | (any) | – | Used to clear embryos (component of BABB) |
| Bovine serum albumin | Biowest | P6154 | For immunofluorescence |
| Coverglass 20×20 mm #0 | (any) | – | 100um thick |
| Coverglass 20×20 mm #1 | (any) | – | 170um thick |
| Coverglass 20×60 mm #1.5 | (any) | – | To use as “slides” |
| DAPI (4’,6-Diamidino-2- Phenylindole Dihydrochloride) | Life Technologies | D3571 | For immunofluorescence |
| Drishti software | (open source) | – | Free software tool |
| EDTA | Sigma | ED2SS | For demineralization |
| Fiji/ImageJ software | (open source) | – | Free software tool |
| Glycine | NZYtech | MB01401 | For immunofluorescence |
| Huygens software | Scientific Volume Imaging | – | Commerial software tool |
| HyClone defined fetal bovine serum | GE Healthcare | #HYCLSH30070.03 | For live imaging |
| Hydrogen peroxide solution 30 % | Milipore | 1085971000 | For clearing |
| Imaris software | Bitplane / Oxford instruments | – | Commerial software tool |
| iSpacers | SunJin Lab | (varies) | Use as spacers for preparations |
| L-glutamine | Gibco | #25030–024 | For live imaging medium |
| Low glucose DMEM | Gibco | 11054020 | For live imaging medium |
| M2 medium | Sigma | M7167 | To dissect embryos |
| Methanol | VWR | VWRC20847.307 | For dehydration and rehydration steps |
| Methyl salicylate | Sigma | M6752 | Used to clear embryos |
| Paraformaldehyde | Sigma | P6148 | Used in solution to fix embryos |
| Penicillin-streptomycin | Sigma | #P0781 | For live imaging medium |
| PBS (Phosphate-buffered saline solution) | Biowest | L0615-500 | – |
| RapiClear | SunJin Laboratory | RapiClear 1.52 | Used to clear embryos |
| Secure-Sea hybridization chambers | Sigma | C5474 | Use as spacers for preparations |
| simLab software | SimLab soft | – | Commerial software tool |
| Slide, depression concave glass – 75×25 mm | (any) | – | To mount thick embryos. |
| Triton X-100 | Sigma | T8787 | For immunofluorescence |
References
- Wilson, V., Olivera-Martinez, I., Storey, K. G. Stem cells, signals and vertebrate body axis extension. Development. 136 (12), 2133 (2009).
- Dias, A., Aires, R. Axial Stem Cells and the Formation of the Vertebrate Body. Concepts and Applications of Stem Cell Biology. , 131-158 (2020).
- Tzouanacou, E., Wegener, A., Wymeersch, F. J., Wilson, V., Nicolas, J. F. Redefining the Progression of Lineage Segregations during Mammalian Embryogenesis by Clonal Analysis. Developmental Cell. 17 (3), 365-376 (2009).
- Aires, R., Dias, A., Mallo, M. Deconstructing the molecular mechanisms shaping the vertebrate body plan. Current Opinion in Cell Biology. 55, 81-86 (2018).
- Wymeersch, F. J., et al. Position-dependent plasticity of distinct progenitor types in the primitive streak. eLife. 5, 10042 (2016).
- Koch, F., et al. Antagonistic Activities of Sox2 and Brachyury Control the Fate Choice of Neuro-Mesodermal Progenitors. Developmental Cell. 42 (5), 514-526 (2017).
- Chapman, D. L., Papaioannou, V. E. Three neural tubes in mouse embryos with mutations in the T-box gene Tbx6. Nature. 391 (1991), 695-697 (1998).
- de Lemos, L., Dias, A., Nóvoa, A., Mallo, M. Epha1 is a cell surface marker for neuromesodermal progenitors and their early mesoderm derivatives. bioRxiv. , 584524 (2020).
- Takada, S., Stark, K. L., Shea, M. J., Vassileva, G., McMahon, J. A., McMahon, A. P. Wnt-3a regulates somite and tailbud formation in the mouse embryo. Genes and Development. 8 (2), 174-189 (1994).
- Chalamalasetty, R. B., et al. Mesogenin 1 is a master regulator of paraxial presomitic mesoderm differentiation. Development. 141 (22), 4285-4297 (2014).
- Pais-de-Azevedo, T., Magno, R., Duarte, I., Palmeirim, I. Recent advances in understanding the mechanisms determining longevity. F1000Research. 7, 97 (2018).
- Hubaud, A., Pourquié, O. Signalling dynamics in vertebrate segmentation. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 15 (11), 709-721 (2014).
- Pourquié, O. Vertebrate segmentation: From cyclic gene networks to scoliosis. Cell. 145 (5), 650-663 (2011).
- Mallo, M. Revisiting the involvement of signaling gradients in somitogenesis. FEBS Journal. 283 (8), 1430-1437 (2016).
- Boulet, A. M., Capecchi, M. R. Signaling by FGF4 and FGF8 is required for axial elongation of the mouse embryo. Developmental Biology. 371 (2), 235-245 (2012).
- Dickinson, M. E., et al. High-throughput discovery of novel developmental phenotypes. Nature. 537 (7621), 508-514 (2016).
- McDole, K., et al. In toto Imaging and Reconstruction of Post-Implantation Mouse Development at the Single-Cell Level. Cell. 175, 859-876 (2018).
- McColl, J., Mok, G. F., Lippert, A. H., Ponjavic, A., Muresan, L., Münsterberg, A. 4D imaging reveals stage dependent random and directed cell motion during somite morphogenesis. Scientific Reports. 8 (1), 12644 (2018).
- Martins, G. G., Rifes, P., Amaândio, R., Rodrigues, G., Palmeirim, I., Thorsteinsdóttir, S. Dynamic 3D cell rearrangements guided by a fibronectin matrix underlie somitogenesis. PLoS ONE. 4 (10), 7429 (2009).
- Bénazéraf, B., et al. Multi-scale quantification of tissue behavior during amniote embryo axis elongation. Development. 144, 4462-4472 (2017).
- Sharpe, J. Optical Projection Tomography. Advanced Imaging in Biology and Medicine. , 199-224 (2009).
- Sharpe, J., et al. Optical projection tomography as a tool for 3D microscopy and gene expression studies. Science. 296 (5567), 541-545 (2002).
- Aulehla, A., et al. A beta-catenin gradient links the clock and wavefront systems in mouse embryo segmentation. Nature Cell Biology. 10 (2), 186-193 (2008).
- Osorno, R., et al. The developmental dismantling of pluripotency is reversed by ectopic Oct4 expression. Development. 139 (13), 2288-2298 (2012).
- Bryson-Richardson, R. J., Currie, P. D. Optical projection tomography for spatio-temporal analysis in zebrafish. Methods in Cell Biology. 76, 37-50 (2004).
- Quintana, L., Sharpe, J. Optical projection tomography of vertebrate embryo development. Cold Spring Harbor Protocols. 6 (6), 586-594 (2011).
- Cho, A., Suzuki, S., Hatakeyama, J., Haruyama, N., Kulkarni, A. B. A Method for Rapid Demineralization of Teeth and Bones. The Open Dentistry Journal. 4 (1), 223-229 (2010).
- Gualda, E. J., Vale, T., Almada, P., Feijó, J. A., Martins, G. G., Moreno, N. OpenSpinMicroscopy: An open-source integrated microscopy platform. Nature Methods. 10 (7), 599-600 (2013).
- Schindelin, J., et al. Fiji: An open-source platform for biological-image analysis. Nature Methods. 9 (7), 676-682 (2012).
- Weigert, M., et al. Content-aware image restoration: pushing the limits of fluorescence microscopy. Nature Methods. 15 (12), 1090-1097 (2018).
- Krull, A., Buchholz, T. O., Jug, F. Noise2void-learning denoising from single noisy images. 2019 IEEE. CVF Conference on Computer Vision and Pattern Recognition (CVPR). , 2124-2132 (2018).
- Sage, D., et al. DeconvolutionLab2: An open-source software for deconvolution microscopy. Methods. 115, 28-41 (2017).
- Pietzsch, T., Saalfeld, S., Preibisch, S., Tomancak, P. BigDataViewer: Visualization and processing for large image data sets. Nature Methods. 12 (6), 481-483 (2015).
- Parslow, A., Cardona, A., Bryson-Richardson, R. J. Sample Drift Correction Following 4D Confocal Time-lapse Imaging. Journal of Visualized Experiments. (86), e51086 (2014).
- Hörl, D., et al. BigStitcher: reconstructing high-resolution image datasets of cleared and expanded samples. Nature Methods. 16, 870-874 (2019).
- Ohser, J., et al. Attenuation correction for confocal laser scanning microscopy and its application in chromatography. Journal of Microscopy. 278, 76-88 (2020).
- Hell, S., Reiner, G., Cremer, C., Stelzer, E. H. K. Aberrations in confocal fluorescence microscopy induced by mismatches in refractive index. Journal of Microscopy. 169, 391-405 (1993).
- Kuypers, L. C., Decraemer, W. F., Dirckx, J. J. J., Timmermans, J. A procedure to determine the correct thickness of an object with confocal microscopy in case of refractive index mismatch. Journal of Microscopy. 218, 68-78 (2005).
- Meijering, E. H. W., Niessen, W. J., Viergever, M. A. Quantitative evaluation of convolution-based methods for medical image interpolation. Medical Image Analysis. 5 (2), 111-126 (2001).
- Limaye, A. Drishti: a volume exploration and presentation tool. Developments in X-Ray Tomography VIII. , 85060 (2012).
- . Thermofisher.com Available from: https://www.thermofisher.com/pt/en/home/industrial/electron-microscopy/electron-microscopy-instruments-workflow-solutions/3d-visualization-analysis-software/3d-visualization-analysis-software-resource-center.html (2020)
- . Simlab-soft.com Available from: https://www.simlab-soft.com/3d-products/Tutorials/simlab-composer-all-Tutorials.aspx?t=3 (2020)
- Dias, A., et al. A TgfbRI/Snai1-dependent developmental module at the core of vertebrate axial elongation. eLife. 9, 56615 (2020).
- Delaune, E. A., François, P., Shih, N. P., Amacher, S. L. Single-Cell-Resolution Imaging of the Impact of Notch Signaling and Mitosis on Segmentation Clock Dynamics. Developmental Cell. 23 (5), 995-1005 (2012).
- Attardi, A., et al. Neuromesodermal progenitors are a conserved source of spinal cord with divergent growth dynamics. Development. 145 (21), (2018).
- Romanos, M., et al. Cell-to-cell heterogeneity in Sox2 and Brachyury expression guides progenitor destiny by controlling their movements. bioRxiv. , 388611 (2020).
- Guillot, C., Michaut, A., Rabe, B., Pourquié, O. Dynamics of primitive streak regression controls the fate of neuro-mesodermal progenitors in the chicken embryo. bioRxiv. , 077586 (2020).
- Steventon, B., Duarte, F., Lagadec, R., Mazan, S., Nicolas, J. F., Hirsinger, E. Species-specific contribution of volumetric growth and tissue convergence to posterior body elongation in vertebrates. Development. 143 (10), 1732-1741 (2016).
- Lawton, A. K., et al. Regulated tissue fluidity steers zebrafish body elongation. Development. 140 (3), 573-582 (2013).
- Huang, Q., et al. Intravital imaging of mouse embryos. Science. 368 (6487), 181-186 (2020).
- Van Den Brink, S. C., et al. Symmetry breaking, germ layer specification and axial organisation in aggregates of mouse embryonic stem cells. Development. 141 (22), 4231-4242 (2014).
- Baillie-Johnson, P., vanden Brink, S. C., Balayo, T., Turner, D. A., Martinez Arias, A. Generation of aggregates of mouse embryonic stem cells that show symmetry breaking, polarization and emergent collective behaviour in vitro. Journal of Visualized Experiments. (105), e53252 (2015).
- Moris, N., et al. An in vitro model of early anteroposterior organization during human development. Nature. 582, 410-415 (2020).
- Rossner, M., Yamada, K. M. What’s in a picture? The temptation of image manipulation. The Journal of Cell Biology. 166 (1), 11-15 (2004).
- North, A. J. Seeing is believing? A beginners’ guide to practical pitfalls in image acquisition. Journal of Cell Biology. 172 (1), 9-18 (2006).
- Jost, A. P. -. T., Waters, J. C. Designing a rigorous microscopy experiment: Validating methods and avoiding bias. Journal of Cell Biology. 218 (5), 1452-1466 (2019).
- Jonkman, J., Brown, C. M., Wright, G. D., Anderson, K. I., North, A. J. Tutorial: guidance for quantitative confocal microscopy. Nature Protocols. 15 (5), 1585-1611 (2020).
- Stauber, M., Sachidanandan, C., Morgenstern, C., Ish-Horowicz, D. Differential axial requirements for Lunatic fringe and Hes7 transcription during mouse somitogenesis. PLoS ONE. 4 (11), 7996 (2009).
- Turnpenny, P. D., et al. Abnormal vertebral segmentation and the notch signaling pathway in man. Developmental Dynamics. 236 (6), 1456-1474 (2007).
- Andrade, R. P., Palmeirim, I., Bajanca, F. Molecular clocks underlying vertebrate embryo segmentation: A 10-year-old hairy-go-round. Birth Defects Research (Part C). 81 (2), 65-83 (2007).
- Sparrow, D. B., et al. Mutation of the LUNATIC FRINGE gene in humans causes spondylocostal dysostosis with a severe vertebral phenotype. American Journal of Human Genetics. 78 (1), 28-37 (2006).
- Giampietro, P. F., et al. Progress in the understanding of the genetic etiology of vertebral segmentation disorders in humans. Annals of the New York Academy of Sciences. 1151, 38-67 (2009).
- Blecher, R., et al. The Proprioceptive System Masterminds Spinal Alignment: Insight into the Mechanism of Scoliosis. Developmental Cell. 42 (4), 388-399 (2017).
- Vianello, S. Exploring and illustrating the mouse embryo virtual objects to think and create with. bioRxiv. , 393991 (2020).
