Drie- en vierdimensionale visualisatie- en analysebenaderingen om gewervelde axiale rek en segmentatie te bestuderen
Summary
Hier beschrijven we computationele hulpmiddelen en methoden die visualisatie en analyse van drie- en vierdimensionale beeldgegevens van muizenembryo’s mogelijk maken in de context van axiale elongatie en segmentatie, verkregen door into optische projectietomografie en door live beeldvorming en whole-mount immunofluorescentiekleuring met behulp van multifotonenmicroscopie.
Abstract
Somitogenese is een kenmerk van de embryonale ontwikkeling van gewervelde dieren. Al jaren bestuderen onderzoekers dit proces in een verscheidenheid aan organismen met behulp van een breed scala aan technieken die ex vivo en in vitro benaderingen omvatten. De meeste studies vertrouwen echter nog steeds op de analyse van tweedimensionale (2D) beeldvormingsgegevens, wat een goede evaluatie van een ontwikkelingsproces zoals axiale extensie en somitogenese met zeer dynamische interacties in een complexe 3D-ruimte beperkt. Hier beschrijven we technieken die muis live imaging acquisitie, datasetverwerking, visualisatie en analyse in 3D en 4D mogelijk maken om de cellen (bijv. Neuromesodermale voorlopers) te bestuderen die betrokken zijn bij deze ontwikkelingsprocessen. We bieden ook een stapsgewijs protocol voor optische projectietomografie en whole-mount immunofluorescentiemicroscopie in muizenembryo’s (van monstervoorbereiding tot beeldacquisitie) en tonen een pijplijn die we hebben ontwikkeld om 3D-beeldgegevens te verwerken en te visualiseren. We breiden het gebruik van sommige van deze technieken uit en benadrukken specifieke kenmerken van verschillende beschikbare software (bijv. Fiji / ImageJ, Drishti, Amira en Imaris) die kunnen worden gebruikt om ons huidige begrip van axiale extensie en somietvorming (bijv. 3D-reconstructies) te verbeteren. Al met al benadrukken de hier beschreven technieken het belang van 3D-gegevensvisualisatie en -analyse in de ontwikkelingsbiologie en kunnen ze andere onderzoekers helpen om 3D- en 4D-beeldgegevens beter aan te pakken in de context van axiale uitbreiding en segmentatie van gewervelde dieren. Ten slotte maakt het werk ook gebruik van nieuwe hulpmiddelen om het onderwijzen van de embryonale ontwikkeling van gewervelde dieren te vergemakkelijken.
Introduction
De vorming van de lichaamsas van gewervelde dieren is een zeer complex en dynamisch proces dat plaatsvindt tijdens de embryonale ontwikkeling. Aan het einde van de gastrulatie [bij de muis, rond embryonale dag (E) 8.0], wordt een groep epiblastvoorlopercellen die bekend staan als neuromesodermale voorlopercellen (NMP’s) een belangrijke aanjager van axiale uitbreiding in een kop-staartsequentie, die de neurale buis en paraxiale mesodermale weefsels genereert tijdens nek-, romp- en staartvorming 1,2,3,4 . Interessant is dat de positie die deze NMP’s innemen in de caudale epiblast een sleutelrol lijkt te spelen in de beslissing om te differentiëren in mesoderm of neuro-emtoderm5. Hoewel we momenteel geen precieze moleculaire vingerafdruk voor NMP’s hebben, wordt over het algemeen gedacht dat deze cellen T (Brachyury) en Sox2 5,6 co-expresseren. De exacte mechanismen die NMP-lotbeslissingen reguleren (d.w.z. of ze neurale of mesodermale routes nemen) beginnen pas nauwkeurig te worden gedefinieerd. Tbx6-expressie in het primitieve streepgebied is een vroege marker van NMP-lotbeslissing, omdat dit gen betrokken is bij de inductie en specificatie van mesoderm 6,7. Interessant is dat vroege mesodermcellen hoge niveaus van Epha18 lijken uit te drukken, en Wnt / β-catenine-signalering, evenals Msgn1 bleken ook een belangrijke rol te spelen bij paraxiale mesodermdifferentiatie en somietvorming 9,10. Een volledige ruimtelijk-temporele analyse van NMP’s op eencellig niveau zal zeker instrumenteel zijn om de moleculaire mechanismen die mesodermspecificatie beheersen volledig te begrijpen.
De vorming van somieten (wervelvoorlopers) is een belangrijk kenmerk van gewervelde dieren. Tijdens axiale elongatie wordt het paraxiale mesoderm gesegmenteerd in een reeks bilaterale herhalende eenheden die bekend staan als somites. Het aantal somites en de tijd die nodig is voor de vorming van nieuwe segmenten varieert per soort11,12. Somitogenese omvat periodieke signaaloscillaties (bekend als de “segmentatieklok”) die kunnen worden waargenomen door de cyclische expressie van verschillende genen van de Notch-, Wnt- en Fgf-signaalroutes in het presomitische mesoderm (bijv. Lfng)11,12. Het huidige model van somitogenese postuleert ook het bestaan van een “rijpingsgolffront”, een reeks complexe signaalgradiënten met Fgf-, Wnt- en retinoïnezuursignalering die de positie van de achterste grens van elke nieuwe somiet bepalen. Een gecoördineerde interactie tussen de “segmentatieklok” en het “rijpingsgolffront” is daarom fundamenteel voor het genereren van deze wervelvoorlopermodules, aangezien verstoringen in deze belangrijke morfogenetische processen kunnen leiden tot embryonale letaliteit of tot de vorming van aangeboren misvormingen (bijv. Scoliose)13,14,15.
Ondanks aanzienlijke recente vooruitgang in beeldvormingstechnieken, biobeeldanalysemethoden en software, zijn de meeste studies van axiale elongatie en somitogenese nog steeds afhankelijk van enkelvoudige / geïsoleerde tweedimensionale beeldgegevens (bijv. Secties), die geen volledige multidimensionale weefselvisualisatie mogelijk maken en een duidelijk onderscheid tussen pathologische misvormingen (d.w.z. als gevolg van mutaties) versus normale morfologische variatie tijdens de embryonale ontwikkeling bemoeilijken16 . Beeldvorming in 3D heeft al nieuwe morfogenetische bewegingen blootgelegd, voorheen niet geïdentificeerd door standaard 2D-methoden 17,18,19,20, wat de kracht van in toto-beeldvorming benadrukt om de mechanismen van gewervelde somitogenese en axiale extensie te begrijpen.
3D- en 4D-microscopie van muizenembryo’s, met name live beeldvorming, zijn technisch uitdagend en vereisen kritieke stappen tijdens monstervoorbereiding, beeldacquisitie en gegevensvoorverwerking om nauwkeurige en zinvolle spatio-temporele analyse mogelijk te maken. Hier beschrijven we een gedetailleerd protocol voor live beeldvorming en whole-mount immunofluorescentiekleuring van muizenembryo’s, dat kan worden gebruikt om zowel NMP’s als mesodermale cellen te bestuderen tijdens axiale extensie en segmentatie. Daarnaast beschrijven we ook een protocol voor optische projectietomografie (OPT) van oudere embryo’s en foetussen, dat 3D in toto visualisatie en kwantificering van pathologische afwijkingen mogelijk maakt die het gevolg kunnen zijn van problemen tijdens somitogenese (bijv. Botfusie en scoliose)13,21,22. Ten slotte illustreren we de kracht van 3D-beeldvormingsreconstructies in de studie en het onderwijs van gewervelde segmentatie en axiale elongatie.
Protocol
Representative Results
Discussion
Axiale verlenging en segmentatie zijn twee van de meest complexe en dynamische processen die plaatsvinden tijdens de embryonale ontwikkeling van gewervelde dieren. Het gebruik van 3D- en 4D-beeldvorming met single-cell tracking wordt al enige tijd toegepast om deze processen te bestuderen bij zowel zebravis- als kippenembryo’s, waarvoor toegankelijkheid en kweekomstandigheden complexe beeldvormingvergemakkelijken 19,44,45,46,47,48,49 …
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
We willen Olivier Pourquié en Alexander Aulehla bedanken voor de LuVeLu reporter-stam, het SunJin-laboratorium voor het RapiClear-testmonster, Hugo Pereira voor de hulp bij het gebruik van BigStitcher, Nuno Granjeiro voor het helpen opzetten van het live beeldvormingsapparaat, de IGC-dierenfaciliteit en voormalige en huidige leden van het Mallo-lab voor nuttige opmerkingen en ondersteuning tijdens dit werk.
We danken de technische ondersteuning van de Advanced Imaging Facility van de IGC, die wordt ondersteund door Portugese financiering ref# PPBI-POCI-01-0145-FEDER-022122 en ref# PTDC/BII-BTI/32375/2017, medegefinancierd door het regionaal operationeel programma van Lissabon (Lisboa 2020), in het kader van de partnerschapsovereenkomst van Portugal 2020, via het Europees Fonds voor Regionale Ontwikkeling (FEDER) en Fundação para a Ciência e a Tecnologia (FCT, Portugal). Het werk beschreven in dit manuscript werd ondersteund door subsidies LISBOA-01-0145-FEDER-030254 (FCT, Portugal) en SCML-MC-60-2014 (Santa Casa da Misericórdia, Portugal) aan M.M., de onderzoeksinfrastructuur Congento, project LISBOA-01-0145-FEDER-022170, en de PhD fellowship PD/BD/128426/2017 aan A.D.
Materials
| Agarose low gelling temperature | Sigma | A9414 | Used to mounting embryos (e.g. for OPT) |
| Amira software | Thermofisher | – | Commerial software tool |
| Anti-Brachyury (Goat polyclonal) | R and D Systems | AF2085 RRID:AB_2200235 | For immunofluorescence |
| Anti-Sox2 (Rabbit monoclonal) | Abcam | ab92494 RRID:AB_10585428 | For immunofluorescence |
| Anti-Tbx6 (Goat polyclonal) | R and D Systems | AF4744 RRID:AB_2200834 | For immunofluorescence |
| Anti-Laminin111 (Rabbit polyclonal) | Sigma | L9393 RRID:AB_477163 | For immunofluorescence |
| Anti-goat 488 (Donkey polyclonal) | Molecular Probes | A11055 RRID:AB_2534102 | For immunofluorescence |
| Anti-rabbit 568 (Donkey polyclonal) | ThermoFisher Scientific | A10042 RRID:AB_2534017 | For immunofluorescence |
| Benzyl Alcohol (99+%) | (any) | – | Used to clear embryos (component of BABB) |
| Benzyl Benzoate (99+%) | (any) | – | Used to clear embryos (component of BABB) |
| Bovine serum albumin | Biowest | P6154 | For immunofluorescence |
| Coverglass 20×20 mm #0 | (any) | – | 100um thick |
| Coverglass 20×20 mm #1 | (any) | – | 170um thick |
| Coverglass 20×60 mm #1.5 | (any) | – | To use as “slides” |
| DAPI (4’,6-Diamidino-2- Phenylindole Dihydrochloride) | Life Technologies | D3571 | For immunofluorescence |
| Drishti software | (open source) | – | Free software tool |
| EDTA | Sigma | ED2SS | For demineralization |
| Fiji/ImageJ software | (open source) | – | Free software tool |
| Glycine | NZYtech | MB01401 | For immunofluorescence |
| Huygens software | Scientific Volume Imaging | – | Commerial software tool |
| HyClone defined fetal bovine serum | GE Healthcare | #HYCLSH30070.03 | For live imaging |
| Hydrogen peroxide solution 30 % | Milipore | 1085971000 | For clearing |
| Imaris software | Bitplane / Oxford instruments | – | Commerial software tool |
| iSpacers | SunJin Lab | (varies) | Use as spacers for preparations |
| L-glutamine | Gibco | #25030–024 | For live imaging medium |
| Low glucose DMEM | Gibco | 11054020 | For live imaging medium |
| M2 medium | Sigma | M7167 | To dissect embryos |
| Methanol | VWR | VWRC20847.307 | For dehydration and rehydration steps |
| Methyl salicylate | Sigma | M6752 | Used to clear embryos |
| Paraformaldehyde | Sigma | P6148 | Used in solution to fix embryos |
| Penicillin-streptomycin | Sigma | #P0781 | For live imaging medium |
| PBS (Phosphate-buffered saline solution) | Biowest | L0615-500 | – |
| RapiClear | SunJin Laboratory | RapiClear 1.52 | Used to clear embryos |
| Secure-Sea hybridization chambers | Sigma | C5474 | Use as spacers for preparations |
| simLab software | SimLab soft | – | Commerial software tool |
| Slide, depression concave glass – 75×25 mm | (any) | – | To mount thick embryos. |
| Triton X-100 | Sigma | T8787 | For immunofluorescence |
References
- Wilson, V., Olivera-Martinez, I., Storey, K. G. Stem cells, signals and vertebrate body axis extension. Development. 136 (12), 2133 (2009).
- Dias, A., Aires, R. Axial Stem Cells and the Formation of the Vertebrate Body. Concepts and Applications of Stem Cell Biology. , 131-158 (2020).
- Tzouanacou, E., Wegener, A., Wymeersch, F. J., Wilson, V., Nicolas, J. F. Redefining the Progression of Lineage Segregations during Mammalian Embryogenesis by Clonal Analysis. Developmental Cell. 17 (3), 365-376 (2009).
- Aires, R., Dias, A., Mallo, M. Deconstructing the molecular mechanisms shaping the vertebrate body plan. Current Opinion in Cell Biology. 55, 81-86 (2018).
- Wymeersch, F. J., et al. Position-dependent plasticity of distinct progenitor types in the primitive streak. eLife. 5, 10042 (2016).
- Koch, F., et al. Antagonistic Activities of Sox2 and Brachyury Control the Fate Choice of Neuro-Mesodermal Progenitors. Developmental Cell. 42 (5), 514-526 (2017).
- Chapman, D. L., Papaioannou, V. E. Three neural tubes in mouse embryos with mutations in the T-box gene Tbx6. Nature. 391 (1991), 695-697 (1998).
- de Lemos, L., Dias, A., Nóvoa, A., Mallo, M. Epha1 is a cell surface marker for neuromesodermal progenitors and their early mesoderm derivatives. bioRxiv. , 584524 (2020).
- Takada, S., Stark, K. L., Shea, M. J., Vassileva, G., McMahon, J. A., McMahon, A. P. Wnt-3a regulates somite and tailbud formation in the mouse embryo. Genes and Development. 8 (2), 174-189 (1994).
- Chalamalasetty, R. B., et al. Mesogenin 1 is a master regulator of paraxial presomitic mesoderm differentiation. Development. 141 (22), 4285-4297 (2014).
- Pais-de-Azevedo, T., Magno, R., Duarte, I., Palmeirim, I. Recent advances in understanding the mechanisms determining longevity. F1000Research. 7, 97 (2018).
- Hubaud, A., Pourquié, O. Signalling dynamics in vertebrate segmentation. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 15 (11), 709-721 (2014).
- Pourquié, O. Vertebrate segmentation: From cyclic gene networks to scoliosis. Cell. 145 (5), 650-663 (2011).
- Mallo, M. Revisiting the involvement of signaling gradients in somitogenesis. FEBS Journal. 283 (8), 1430-1437 (2016).
- Boulet, A. M., Capecchi, M. R. Signaling by FGF4 and FGF8 is required for axial elongation of the mouse embryo. Developmental Biology. 371 (2), 235-245 (2012).
- Dickinson, M. E., et al. High-throughput discovery of novel developmental phenotypes. Nature. 537 (7621), 508-514 (2016).
- McDole, K., et al. In toto Imaging and Reconstruction of Post-Implantation Mouse Development at the Single-Cell Level. Cell. 175, 859-876 (2018).
- McColl, J., Mok, G. F., Lippert, A. H., Ponjavic, A., Muresan, L., Münsterberg, A. 4D imaging reveals stage dependent random and directed cell motion during somite morphogenesis. Scientific Reports. 8 (1), 12644 (2018).
- Martins, G. G., Rifes, P., Amaândio, R., Rodrigues, G., Palmeirim, I., Thorsteinsdóttir, S. Dynamic 3D cell rearrangements guided by a fibronectin matrix underlie somitogenesis. PLoS ONE. 4 (10), 7429 (2009).
- Bénazéraf, B., et al. Multi-scale quantification of tissue behavior during amniote embryo axis elongation. Development. 144, 4462-4472 (2017).
- Sharpe, J. Optical Projection Tomography. Advanced Imaging in Biology and Medicine. , 199-224 (2009).
- Sharpe, J., et al. Optical projection tomography as a tool for 3D microscopy and gene expression studies. Science. 296 (5567), 541-545 (2002).
- Aulehla, A., et al. A beta-catenin gradient links the clock and wavefront systems in mouse embryo segmentation. Nature Cell Biology. 10 (2), 186-193 (2008).
- Osorno, R., et al. The developmental dismantling of pluripotency is reversed by ectopic Oct4 expression. Development. 139 (13), 2288-2298 (2012).
- Bryson-Richardson, R. J., Currie, P. D. Optical projection tomography for spatio-temporal analysis in zebrafish. Methods in Cell Biology. 76, 37-50 (2004).
- Quintana, L., Sharpe, J. Optical projection tomography of vertebrate embryo development. Cold Spring Harbor Protocols. 6 (6), 586-594 (2011).
- Cho, A., Suzuki, S., Hatakeyama, J., Haruyama, N., Kulkarni, A. B. A Method for Rapid Demineralization of Teeth and Bones. The Open Dentistry Journal. 4 (1), 223-229 (2010).
- Gualda, E. J., Vale, T., Almada, P., Feijó, J. A., Martins, G. G., Moreno, N. OpenSpinMicroscopy: An open-source integrated microscopy platform. Nature Methods. 10 (7), 599-600 (2013).
- Schindelin, J., et al. Fiji: An open-source platform for biological-image analysis. Nature Methods. 9 (7), 676-682 (2012).
- Weigert, M., et al. Content-aware image restoration: pushing the limits of fluorescence microscopy. Nature Methods. 15 (12), 1090-1097 (2018).
- Krull, A., Buchholz, T. O., Jug, F. Noise2void-learning denoising from single noisy images. 2019 IEEE. CVF Conference on Computer Vision and Pattern Recognition (CVPR). , 2124-2132 (2018).
- Sage, D., et al. DeconvolutionLab2: An open-source software for deconvolution microscopy. Methods. 115, 28-41 (2017).
- Pietzsch, T., Saalfeld, S., Preibisch, S., Tomancak, P. BigDataViewer: Visualization and processing for large image data sets. Nature Methods. 12 (6), 481-483 (2015).
- Parslow, A., Cardona, A., Bryson-Richardson, R. J. Sample Drift Correction Following 4D Confocal Time-lapse Imaging. Journal of Visualized Experiments. (86), e51086 (2014).
- Hörl, D., et al. BigStitcher: reconstructing high-resolution image datasets of cleared and expanded samples. Nature Methods. 16, 870-874 (2019).
- Ohser, J., et al. Attenuation correction for confocal laser scanning microscopy and its application in chromatography. Journal of Microscopy. 278, 76-88 (2020).
- Hell, S., Reiner, G., Cremer, C., Stelzer, E. H. K. Aberrations in confocal fluorescence microscopy induced by mismatches in refractive index. Journal of Microscopy. 169, 391-405 (1993).
- Kuypers, L. C., Decraemer, W. F., Dirckx, J. J. J., Timmermans, J. A procedure to determine the correct thickness of an object with confocal microscopy in case of refractive index mismatch. Journal of Microscopy. 218, 68-78 (2005).
- Meijering, E. H. W., Niessen, W. J., Viergever, M. A. Quantitative evaluation of convolution-based methods for medical image interpolation. Medical Image Analysis. 5 (2), 111-126 (2001).
- Limaye, A. Drishti: a volume exploration and presentation tool. Developments in X-Ray Tomography VIII. , 85060 (2012).
- . Thermofisher.com Available from: https://www.thermofisher.com/pt/en/home/industrial/electron-microscopy/electron-microscopy-instruments-workflow-solutions/3d-visualization-analysis-software/3d-visualization-analysis-software-resource-center.html (2020)
- . Simlab-soft.com Available from: https://www.simlab-soft.com/3d-products/Tutorials/simlab-composer-all-Tutorials.aspx?t=3 (2020)
- Dias, A., et al. A TgfbRI/Snai1-dependent developmental module at the core of vertebrate axial elongation. eLife. 9, 56615 (2020).
- Delaune, E. A., François, P., Shih, N. P., Amacher, S. L. Single-Cell-Resolution Imaging of the Impact of Notch Signaling and Mitosis on Segmentation Clock Dynamics. Developmental Cell. 23 (5), 995-1005 (2012).
- Attardi, A., et al. Neuromesodermal progenitors are a conserved source of spinal cord with divergent growth dynamics. Development. 145 (21), (2018).
- Romanos, M., et al. Cell-to-cell heterogeneity in Sox2 and Brachyury expression guides progenitor destiny by controlling their movements. bioRxiv. , 388611 (2020).
- Guillot, C., Michaut, A., Rabe, B., Pourquié, O. Dynamics of primitive streak regression controls the fate of neuro-mesodermal progenitors in the chicken embryo. bioRxiv. , 077586 (2020).
- Steventon, B., Duarte, F., Lagadec, R., Mazan, S., Nicolas, J. F., Hirsinger, E. Species-specific contribution of volumetric growth and tissue convergence to posterior body elongation in vertebrates. Development. 143 (10), 1732-1741 (2016).
- Lawton, A. K., et al. Regulated tissue fluidity steers zebrafish body elongation. Development. 140 (3), 573-582 (2013).
- Huang, Q., et al. Intravital imaging of mouse embryos. Science. 368 (6487), 181-186 (2020).
- Van Den Brink, S. C., et al. Symmetry breaking, germ layer specification and axial organisation in aggregates of mouse embryonic stem cells. Development. 141 (22), 4231-4242 (2014).
- Baillie-Johnson, P., vanden Brink, S. C., Balayo, T., Turner, D. A., Martinez Arias, A. Generation of aggregates of mouse embryonic stem cells that show symmetry breaking, polarization and emergent collective behaviour in vitro. Journal of Visualized Experiments. (105), e53252 (2015).
- Moris, N., et al. An in vitro model of early anteroposterior organization during human development. Nature. 582, 410-415 (2020).
- Rossner, M., Yamada, K. M. What’s in a picture? The temptation of image manipulation. The Journal of Cell Biology. 166 (1), 11-15 (2004).
- North, A. J. Seeing is believing? A beginners’ guide to practical pitfalls in image acquisition. Journal of Cell Biology. 172 (1), 9-18 (2006).
- Jost, A. P. -. T., Waters, J. C. Designing a rigorous microscopy experiment: Validating methods and avoiding bias. Journal of Cell Biology. 218 (5), 1452-1466 (2019).
- Jonkman, J., Brown, C. M., Wright, G. D., Anderson, K. I., North, A. J. Tutorial: guidance for quantitative confocal microscopy. Nature Protocols. 15 (5), 1585-1611 (2020).
- Stauber, M., Sachidanandan, C., Morgenstern, C., Ish-Horowicz, D. Differential axial requirements for Lunatic fringe and Hes7 transcription during mouse somitogenesis. PLoS ONE. 4 (11), 7996 (2009).
- Turnpenny, P. D., et al. Abnormal vertebral segmentation and the notch signaling pathway in man. Developmental Dynamics. 236 (6), 1456-1474 (2007).
- Andrade, R. P., Palmeirim, I., Bajanca, F. Molecular clocks underlying vertebrate embryo segmentation: A 10-year-old hairy-go-round. Birth Defects Research (Part C). 81 (2), 65-83 (2007).
- Sparrow, D. B., et al. Mutation of the LUNATIC FRINGE gene in humans causes spondylocostal dysostosis with a severe vertebral phenotype. American Journal of Human Genetics. 78 (1), 28-37 (2006).
- Giampietro, P. F., et al. Progress in the understanding of the genetic etiology of vertebral segmentation disorders in humans. Annals of the New York Academy of Sciences. 1151, 38-67 (2009).
- Blecher, R., et al. The Proprioceptive System Masterminds Spinal Alignment: Insight into the Mechanism of Scoliosis. Developmental Cell. 42 (4), 388-399 (2017).
- Vianello, S. Exploring and illustrating the mouse embryo virtual objects to think and create with. bioRxiv. , 393991 (2020).
