Summary

脊椎動物の軸の伸びとセグメンテーションを研究するための3次元および4次元の可視化と解析アプローチ

Published: February 28, 2021
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Summary

ここでは、in toto光投影断層撮影法、多光子顕微鏡を用いたライブイメージングおよびホールマウント免疫蛍光染色によって得られた、軸方向の伸長およびセグメンテーションの文脈におけるマウス胚の3次元および4次元画像データの視覚化および解析を可能にする計算ツールおよび方法について説明する。

Abstract

ソミトジェネシスは脊椎動物の胚発生の特徴である。長年にわたり、研究者は、エクスビボおよびインビトロアプローチを包含する幅広い技術を使用して、さまざまな生物におけるこのプロセスを研究してきました。しかし、ほとんどの研究は依然として2次元(2D)イメージングデータの解析に依存しているため、複雑な3D空間での非常に動的な相互作用を伴う軸の延長やソミトジェネシスなどの発生プロセスの適切な評価が制限されています。ここでは、マウスのライブイメージング取得、データセット処理、視覚化、および3Dおよび4Dでの解析を可能にし、これらの発生プロセスに関与する細胞(例えば、神経中胚葉前駆細胞)を研究することを可能にする技術について説明する。また、マウス胚における光投影断層撮影法およびホールマウント免疫蛍光顕微鏡(サンプル調製から画像取得まで)のためのステップバイステップのプロトコルを提供し、3D画像データを処理および視覚化するために開発したパイプラインを示します。これらの技術のいくつかの使用を拡張し、軸方向の拡張とソマイト形成(3D再構成など)の現在の理解を向上させるために使用できる、利用可能なさまざまなソフトウェア(フィジー/ ImageJ、Drishti、Amira、Imarisなど)の特定の機能を強調します。全体として、ここで説明する技術は、発生生物学における3Dデータの視覚化と分析の重要性を強調しており、他の研究者が脊椎動物の軸延長とセグメンテーションの文脈で3Dおよび4D画像データにうまく対処するのに役立ちます。最後に、この研究は脊椎動物の胚発生を教えることを容易にするための新しいツールも採用しています。

Introduction

脊椎動物の体軸形成は、胚発生中に起こる非常に複雑で動的なプロセスです。胃形成の終わりに[マウスでは、胚発生日(E)8.0頃]に、神経中胚葉前駆細胞(NMP)として知られるエピブラスト前駆細胞のグループが、頭から尾への配列における軸延長の重要な駆動因子となり、頸部、体幹および尾部形成中に神経管および近軸中胚葉系組織を生成する1234.興味深いことに、これらのNMPが尾側エピブラストで占める位置は、中胚葉または神経外胚葉に分化する決定において重要な役割を果たしているようです5。現在、NMPの正確な分子指紋は得られていませんが、これらの細胞は一般にT(Brachyury)とSox2 5,6を共発現すると考えられています。NMPの運命決定を調節する正確なメカニズム(すなわち、それらが神経経路をとるか中胚葉経路をとるか)は、正確に定義され始めたばかりである。原始的な筋状領域におけるTbx6発現は、NMP運命決定の初期マーカーであり、この遺伝子は中胚葉67の誘導および仕様に関与している。興味深いことに、初期の中胚葉細胞は高レベルのEpha18を発現しているようであり、Wnt/β-カテニンシグナル伝達、ならびにMsgn1もまた、近軸中胚葉分化およびソマイト形成において重要な役割を果たすことが示された9,10単一細胞レベルでのNMPの完全な空間時間解析は、中胚葉の仕様を制御する分子メカニズムを完全に理解するために確かに役立つでしょう。

ソマイト(椎骨前駆体)の形成は脊椎動物の重要な特徴である。軸方向の伸長の間、近軸中胚葉はソマイトとして知られる一連の両側反復単位でセグメント化される。ソマイトの数と新しいセグメントの形成に必要な時間は、種1112によって異なります。ソミトジェネシスは、前嚢内胚葉(例えば、Lfng)におけるNotch、WntおよびFgfシグナル伝達経路のいくつかの遺伝子の周期的発現によって観察され得る周期的シグナル伝達振動(「セグメンテーションクロック」として知られている)1112を含む。ソミトジェネシスの現在のモデルはまた、各新しいソマイトの後縁の位置を定義するFgf、Wntおよびレチノイン酸シグナル伝達を含む一連の複雑なシグナル伝達勾配である「成熟波面」の存在を仮定する。したがって、「セグメンテーションクロック」と「成熟波面」との間の協調的な相互作用は、これらの重要な形態形成過程における摂動が胚致死性または先天性奇形(例えば、脊柱側弯症)の形成をもたらす可能性があるためこれらの椎骨前駆体モジュールの生成にとって基本的である13,14,15

画像化技術、バイオイメージ解析方法およびソフトウェアにおける最近の大幅な進歩にもかかわらず、軸方向の伸長およびソミトジェネシスのほとんどの研究は、依然として単一/単離された2次元画像データ(例えば、切片)に依存しており、完全な多次元組織可視化を可能とせず、病理学的奇形(すなわち、突然変異による)と胚発生中に起こる正常な形態学的変化との間の明確な区別を複雑にする16。.3Dでのイメージングは、以前は標準的な2D法では同定されていなかった新しい形態形成運動をすでに明らかにしており17,18,19,20、脊椎動物のソミトジェネシスおよび軸方向拡張のメカニズムを理解するためのin totoイメージングの力を強調している。

マウス胚の3Dおよび4D顕微鏡、特にライブイメージングは技術的に困難であり、正確で意味のある時空間分析を可能にするために、サンプル調製、画像取得、およびデータ前処理中に重要なステップが必要です。ここでは、マウス胚のライブイメージングおよびホールマウント免疫蛍光染色のための詳細なプロトコールについて述べ、軸延長およびセグメンテーション中にNMPおよび中胚葉系細胞の両方を研究するために使用することができる。さらに、我々はまた、トトにおける3D可視化および染色体形成中の問題(例えば、骨癒合および脊柱側弯症)に起因する病理学的異常の定量化を可能にする、高齢胚および胎児の光投影断層撮影(OPT)のためのプロトコルについても記述する13,21,22。最後に、脊椎動物のセグメンテーションと軸方向の伸びの研究と教育における3Dイメージング再構成の力を示します。

Protocol

動物を対象とした実験は、住宅、畜産、福祉に関するポルトガル(Portaria 1005/92)および欧州(指令2010/63/EU)の法律に従っていました。このプロジェクトは、「Instituto Gulbenkian de Ciência」の倫理委員会とポルトガルの国家機関「Direcção Geral de Alimentação e Veterinária」(ライセンス参照:014308)によってレビューされ、承認されました。 1. 3Dおよび4Dイメージング用のサンプル調製 <p…

Representative Results

ライブおよび免疫蛍光イメージングの両方についてこの論文に示された代表的な結果は、20×1.0NAの水対物レンズ、960nmに同調された励起レーザー、およびGaAsP光検出器(Dias et al. (2020)43に記載されているように)を備えた2光子システムを使用して得られた。光学投影断層撮影は、カスタムビルドのOPenTスキャナ(Gualda et al. (2013)28に記載されているように)を使用?…

Discussion

軸方向の伸長とセグメンテーションは、脊椎動物の胚発生中に起こる最も複雑で動的なプロセスの2つです。単一細胞追跡を伴う3Dおよび4Dイメージングの使用は、しばらくの間、ゼブラフィッシュおよびニワトリ胚の両方においてこれらのプロセスを研究するために適用されており、そのためにアクセス可能性および培養条件が複雑なイメージングを容易にする19、44、45、46…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

LuVeLuレポーター株のオリビエ・プルキエとアレクサンダー・オーレフラ、RapiClearテストサンプルのSunJin研究所、BigStitcherを使用した支援のHugo Pereira、ライブイメージング装置のセットアップを支援してくれたNuno Granjeiro、IGC動物施設、およびこの作業の過程で有益なコメントとサポートを提供してくれたMalloラボの過去および現在のメンバーに感謝します。

我々は、ポルトガル2020年パートナーシップ協定に基づき、欧州地域開発基金(FEDER)及びFundação para a Ciência e a Tecnologia(FCT, Portugal)を通じて、リスボン地域運用プログラム(Lisboa 2020)が共同出資する、ポルトガルの資金提供 ref# PPBI-POCI-01-0145-FEDER-022122及びref# PTDC/BII-BTI/32375/2017の支援を受けているIGCの先進イメージングファシリティの技術支援に感謝する。この原稿に記載されている研究は、研究インフラCongento、プロジェクトLISBOA-01-0145-FEDER-030254(FCT、ポルトガル)およびSCML-MC-60-2014(サンタカーサダミゼリコルディア、ポルトガル)に助成金を支給し、M.M、研究インフラCongento、プロジェクトLISBOA-01-0145-FEDER-022170、およびPhDフェローシップPD/BD/128426/2017からADへの助成金によって支援されました。

Materials

Agarose low gelling temperature Sigma A9414 Used to mounting embryos (e.g. for OPT)
Amira software Thermofisher Commerial software tool
Anti-Brachyury (Goat polyclonal) R and D Systems AF2085 RRID:AB_2200235 For immunofluorescence
Anti-Sox2 (Rabbit monoclonal) Abcam ab92494 RRID:AB_10585428 For immunofluorescence
Anti-Tbx6 (Goat polyclonal) R and D Systems AF4744 RRID:AB_2200834 For immunofluorescence
Anti-Laminin111 (Rabbit polyclonal) Sigma L9393 RRID:AB_477163 For immunofluorescence
Anti-goat 488 (Donkey polyclonal) Molecular Probes A11055 RRID:AB_2534102 For immunofluorescence
Anti-rabbit 568 (Donkey polyclonal) ThermoFisher   Scientific A10042 RRID:AB_2534017 For immunofluorescence
Benzyl Alcohol (99+%) (any) Used to clear embryos (component of BABB)
Benzyl Benzoate (99+%) (any) Used to clear embryos (component of BABB)
Bovine serum albumin Biowest P6154 For immunofluorescence
Coverglass 20×20 mm #0 (any) 100um thick
Coverglass 20×20 mm #1 (any) 170um thick
Coverglass 20×60 mm #1.5 (any) To use as “slides”
DAPI (4’,6-Diamidino-2- Phenylindole Dihydrochloride) Life Technologies D3571 For immunofluorescence
Drishti software (open source) Free software tool
EDTA Sigma ED2SS For demineralization
Fiji/ImageJ software (open source) Free software tool
Glycine NZYtech MB01401 For immunofluorescence
Huygens software Scientific Volume Imaging Commerial software tool
HyClone defined fetal bovine serum GE Healthcare #HYCLSH30070.03 For live imaging
Hydrogen peroxide solution 30 % Milipore 1085971000 For clearing
Imaris software Bitplane / Oxford instruments Commerial software tool
iSpacers SunJin Lab (varies) Use as spacers for preparations
L-glutamine Gibco #25030–024 For live imaging medium
Low glucose DMEM Gibco 11054020 For live imaging medium
M2 medium Sigma M7167 To dissect embryos
Methanol VWR VWRC20847.307 For dehydration and rehydration steps
Methyl salicylate Sigma M6752 Used to clear embryos
Paraformaldehyde Sigma P6148 Used in solution to fix embryos
Penicillin-streptomycin Sigma #P0781 For live imaging medium
PBS (Phosphate-buffered saline solution) Biowest L0615-500
RapiClear SunJin Laboratory RapiClear 1.52 Used to clear embryos
Secure-Sea hybridization chambers Sigma C5474 Use as spacers for preparations
simLab software SimLab soft Commerial software tool
Slide, depression concave glass – 75×25 mm (any) To mount thick embryos.
Triton X-100 Sigma T8787 For immunofluorescence

References

  1. Wilson, V., Olivera-Martinez, I., Storey, K. G. Stem cells, signals and vertebrate body axis extension. Development. 136 (12), 2133 (2009).
  2. Dias, A., Aires, R. Axial Stem Cells and the Formation of the Vertebrate Body. Concepts and Applications of Stem Cell Biology. , 131-158 (2020).
  3. Tzouanacou, E., Wegener, A., Wymeersch, F. J., Wilson, V., Nicolas, J. F. Redefining the Progression of Lineage Segregations during Mammalian Embryogenesis by Clonal Analysis. Developmental Cell. 17 (3), 365-376 (2009).
  4. Aires, R., Dias, A., Mallo, M. Deconstructing the molecular mechanisms shaping the vertebrate body plan. Current Opinion in Cell Biology. 55, 81-86 (2018).
  5. Wymeersch, F. J., et al. Position-dependent plasticity of distinct progenitor types in the primitive streak. eLife. 5, 10042 (2016).
  6. Koch, F., et al. Antagonistic Activities of Sox2 and Brachyury Control the Fate Choice of Neuro-Mesodermal Progenitors. Developmental Cell. 42 (5), 514-526 (2017).
  7. Chapman, D. L., Papaioannou, V. E. Three neural tubes in mouse embryos with mutations in the T-box gene Tbx6. Nature. 391 (1991), 695-697 (1998).
  8. de Lemos, L., Dias, A., Nóvoa, A., Mallo, M. Epha1 is a cell surface marker for neuromesodermal progenitors and their early mesoderm derivatives. bioRxiv. , 584524 (2020).
  9. Takada, S., Stark, K. L., Shea, M. J., Vassileva, G., McMahon, J. A., McMahon, A. P. Wnt-3a regulates somite and tailbud formation in the mouse embryo. Genes and Development. 8 (2), 174-189 (1994).
  10. Chalamalasetty, R. B., et al. Mesogenin 1 is a master regulator of paraxial presomitic mesoderm differentiation. Development. 141 (22), 4285-4297 (2014).
  11. Pais-de-Azevedo, T., Magno, R., Duarte, I., Palmeirim, I. Recent advances in understanding the mechanisms determining longevity. F1000Research. 7, 97 (2018).
  12. Hubaud, A., Pourquié, O. Signalling dynamics in vertebrate segmentation. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 15 (11), 709-721 (2014).
  13. Pourquié, O. Vertebrate segmentation: From cyclic gene networks to scoliosis. Cell. 145 (5), 650-663 (2011).
  14. Mallo, M. Revisiting the involvement of signaling gradients in somitogenesis. FEBS Journal. 283 (8), 1430-1437 (2016).
  15. Boulet, A. M., Capecchi, M. R. Signaling by FGF4 and FGF8 is required for axial elongation of the mouse embryo. Developmental Biology. 371 (2), 235-245 (2012).
  16. Dickinson, M. E., et al. High-throughput discovery of novel developmental phenotypes. Nature. 537 (7621), 508-514 (2016).
  17. McDole, K., et al. In toto Imaging and Reconstruction of Post-Implantation Mouse Development at the Single-Cell Level. Cell. 175, 859-876 (2018).
  18. McColl, J., Mok, G. F., Lippert, A. H., Ponjavic, A., Muresan, L., Münsterberg, A. 4D imaging reveals stage dependent random and directed cell motion during somite morphogenesis. Scientific Reports. 8 (1), 12644 (2018).
  19. Martins, G. G., Rifes, P., Amaândio, R., Rodrigues, G., Palmeirim, I., Thorsteinsdóttir, S. Dynamic 3D cell rearrangements guided by a fibronectin matrix underlie somitogenesis. PLoS ONE. 4 (10), 7429 (2009).
  20. Bénazéraf, B., et al. Multi-scale quantification of tissue behavior during amniote embryo axis elongation. Development. 144, 4462-4472 (2017).
  21. Sharpe, J. Optical Projection Tomography. Advanced Imaging in Biology and Medicine. , 199-224 (2009).
  22. Sharpe, J., et al. Optical projection tomography as a tool for 3D microscopy and gene expression studies. Science. 296 (5567), 541-545 (2002).
  23. Aulehla, A., et al. A beta-catenin gradient links the clock and wavefront systems in mouse embryo segmentation. Nature Cell Biology. 10 (2), 186-193 (2008).
  24. Osorno, R., et al. The developmental dismantling of pluripotency is reversed by ectopic Oct4 expression. Development. 139 (13), 2288-2298 (2012).
  25. Bryson-Richardson, R. J., Currie, P. D. Optical projection tomography for spatio-temporal analysis in zebrafish. Methods in Cell Biology. 76, 37-50 (2004).
  26. Quintana, L., Sharpe, J. Optical projection tomography of vertebrate embryo development. Cold Spring Harbor Protocols. 6 (6), 586-594 (2011).
  27. Cho, A., Suzuki, S., Hatakeyama, J., Haruyama, N., Kulkarni, A. B. A Method for Rapid Demineralization of Teeth and Bones. The Open Dentistry Journal. 4 (1), 223-229 (2010).
  28. Gualda, E. J., Vale, T., Almada, P., Feijó, J. A., Martins, G. G., Moreno, N. OpenSpinMicroscopy: An open-source integrated microscopy platform. Nature Methods. 10 (7), 599-600 (2013).
  29. Schindelin, J., et al. Fiji: An open-source platform for biological-image analysis. Nature Methods. 9 (7), 676-682 (2012).
  30. Weigert, M., et al. Content-aware image restoration: pushing the limits of fluorescence microscopy. Nature Methods. 15 (12), 1090-1097 (2018).
  31. Krull, A., Buchholz, T. O., Jug, F. Noise2void-learning denoising from single noisy images. 2019 IEEE. CVF Conference on Computer Vision and Pattern Recognition (CVPR). , 2124-2132 (2018).
  32. Sage, D., et al. DeconvolutionLab2: An open-source software for deconvolution microscopy. Methods. 115, 28-41 (2017).
  33. Pietzsch, T., Saalfeld, S., Preibisch, S., Tomancak, P. BigDataViewer: Visualization and processing for large image data sets. Nature Methods. 12 (6), 481-483 (2015).
  34. Parslow, A., Cardona, A., Bryson-Richardson, R. J. Sample Drift Correction Following 4D Confocal Time-lapse Imaging. Journal of Visualized Experiments. (86), e51086 (2014).
  35. Hörl, D., et al. BigStitcher: reconstructing high-resolution image datasets of cleared and expanded samples. Nature Methods. 16, 870-874 (2019).
  36. Ohser, J., et al. Attenuation correction for confocal laser scanning microscopy and its application in chromatography. Journal of Microscopy. 278, 76-88 (2020).
  37. Hell, S., Reiner, G., Cremer, C., Stelzer, E. H. K. Aberrations in confocal fluorescence microscopy induced by mismatches in refractive index. Journal of Microscopy. 169, 391-405 (1993).
  38. Kuypers, L. C., Decraemer, W. F., Dirckx, J. J. J., Timmermans, J. A procedure to determine the correct thickness of an object with confocal microscopy in case of refractive index mismatch. Journal of Microscopy. 218, 68-78 (2005).
  39. Meijering, E. H. W., Niessen, W. J., Viergever, M. A. Quantitative evaluation of convolution-based methods for medical image interpolation. Medical Image Analysis. 5 (2), 111-126 (2001).
  40. Limaye, A. Drishti: a volume exploration and presentation tool. Developments in X-Ray Tomography VIII. , 85060 (2012).
  41. . Thermofisher.com Available from: https://www.thermofisher.com/pt/en/home/industrial/electron-microscopy/electron-microscopy-instruments-workflow-solutions/3d-visualization-analysis-software/3d-visualization-analysis-software-resource-center.html (2020)
  42. . Simlab-soft.com Available from: https://www.simlab-soft.com/3d-products/Tutorials/simlab-composer-all-Tutorials.aspx?t=3 (2020)
  43. Dias, A., et al. A TgfbRI/Snai1-dependent developmental module at the core of vertebrate axial elongation. eLife. 9, 56615 (2020).
  44. Delaune, E. A., François, P., Shih, N. P., Amacher, S. L. Single-Cell-Resolution Imaging of the Impact of Notch Signaling and Mitosis on Segmentation Clock Dynamics. Developmental Cell. 23 (5), 995-1005 (2012).
  45. Attardi, A., et al. Neuromesodermal progenitors are a conserved source of spinal cord with divergent growth dynamics. Development. 145 (21), (2018).
  46. Romanos, M., et al. Cell-to-cell heterogeneity in Sox2 and Brachyury expression guides progenitor destiny by controlling their movements. bioRxiv. , 388611 (2020).
  47. Guillot, C., Michaut, A., Rabe, B., Pourquié, O. Dynamics of primitive streak regression controls the fate of neuro-mesodermal progenitors in the chicken embryo. bioRxiv. , 077586 (2020).
  48. Steventon, B., Duarte, F., Lagadec, R., Mazan, S., Nicolas, J. F., Hirsinger, E. Species-specific contribution of volumetric growth and tissue convergence to posterior body elongation in vertebrates. Development. 143 (10), 1732-1741 (2016).
  49. Lawton, A. K., et al. Regulated tissue fluidity steers zebrafish body elongation. Development. 140 (3), 573-582 (2013).
  50. Huang, Q., et al. Intravital imaging of mouse embryos. Science. 368 (6487), 181-186 (2020).
  51. Van Den Brink, S. C., et al. Symmetry breaking, germ layer specification and axial organisation in aggregates of mouse embryonic stem cells. Development. 141 (22), 4231-4242 (2014).
  52. Baillie-Johnson, P., vanden Brink, S. C., Balayo, T., Turner, D. A., Martinez Arias, A. Generation of aggregates of mouse embryonic stem cells that show symmetry breaking, polarization and emergent collective behaviour in vitro. Journal of Visualized Experiments. (105), e53252 (2015).
  53. Moris, N., et al. An in vitro model of early anteroposterior organization during human development. Nature. 582, 410-415 (2020).
  54. Rossner, M., Yamada, K. M. What’s in a picture? The temptation of image manipulation. The Journal of Cell Biology. 166 (1), 11-15 (2004).
  55. North, A. J. Seeing is believing? A beginners’ guide to practical pitfalls in image acquisition. Journal of Cell Biology. 172 (1), 9-18 (2006).
  56. Jost, A. P. -. T., Waters, J. C. Designing a rigorous microscopy experiment: Validating methods and avoiding bias. Journal of Cell Biology. 218 (5), 1452-1466 (2019).
  57. Jonkman, J., Brown, C. M., Wright, G. D., Anderson, K. I., North, A. J. Tutorial: guidance for quantitative confocal microscopy. Nature Protocols. 15 (5), 1585-1611 (2020).
  58. Stauber, M., Sachidanandan, C., Morgenstern, C., Ish-Horowicz, D. Differential axial requirements for Lunatic fringe and Hes7 transcription during mouse somitogenesis. PLoS ONE. 4 (11), 7996 (2009).
  59. Turnpenny, P. D., et al. Abnormal vertebral segmentation and the notch signaling pathway in man. Developmental Dynamics. 236 (6), 1456-1474 (2007).
  60. Andrade, R. P., Palmeirim, I., Bajanca, F. Molecular clocks underlying vertebrate embryo segmentation: A 10-year-old hairy-go-round. Birth Defects Research (Part C). 81 (2), 65-83 (2007).
  61. Sparrow, D. B., et al. Mutation of the LUNATIC FRINGE gene in humans causes spondylocostal dysostosis with a severe vertebral phenotype. American Journal of Human Genetics. 78 (1), 28-37 (2006).
  62. Giampietro, P. F., et al. Progress in the understanding of the genetic etiology of vertebral segmentation disorders in humans. Annals of the New York Academy of Sciences. 1151, 38-67 (2009).
  63. Blecher, R., et al. The Proprioceptive System Masterminds Spinal Alignment: Insight into the Mechanism of Scoliosis. Developmental Cell. 42 (4), 388-399 (2017).
  64. Vianello, S. Exploring and illustrating the mouse embryo virtual objects to think and create with. bioRxiv. , 393991 (2020).

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Cite This Article
Dias, A., Martins, G. G., Lopes, A., Mallo, M. Three and Four-Dimensional Visualization and Analysis Approaches to Study Vertebrate Axial Elongation and Segmentation. J. Vis. Exp. (168), e62086, doi:10.3791/62086 (2021).

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