脊椎動物の軸の伸びとセグメンテーションを研究するための3次元および4次元の可視化と解析アプローチ
Summary
ここでは、in toto光投影断層撮影法、多光子顕微鏡を用いたライブイメージングおよびホールマウント免疫蛍光染色によって得られた、軸方向の伸長およびセグメンテーションの文脈におけるマウス胚の3次元および4次元画像データの視覚化および解析を可能にする計算ツールおよび方法について説明する。
Abstract
ソミトジェネシスは脊椎動物の胚発生の特徴である。長年にわたり、研究者は、エクスビボおよびインビトロアプローチを包含する幅広い技術を使用して、さまざまな生物におけるこのプロセスを研究してきました。しかし、ほとんどの研究は依然として2次元(2D)イメージングデータの解析に依存しているため、複雑な3D空間での非常に動的な相互作用を伴う軸の延長やソミトジェネシスなどの発生プロセスの適切な評価が制限されています。ここでは、マウスのライブイメージング取得、データセット処理、視覚化、および3Dおよび4Dでの解析を可能にし、これらの発生プロセスに関与する細胞(例えば、神経中胚葉前駆細胞)を研究することを可能にする技術について説明する。また、マウス胚における光投影断層撮影法およびホールマウント免疫蛍光顕微鏡(サンプル調製から画像取得まで)のためのステップバイステップのプロトコルを提供し、3D画像データを処理および視覚化するために開発したパイプラインを示します。これらの技術のいくつかの使用を拡張し、軸方向の拡張とソマイト形成(3D再構成など)の現在の理解を向上させるために使用できる、利用可能なさまざまなソフトウェア(フィジー/ ImageJ、Drishti、Amira、Imarisなど)の特定の機能を強調します。全体として、ここで説明する技術は、発生生物学における3Dデータの視覚化と分析の重要性を強調しており、他の研究者が脊椎動物の軸延長とセグメンテーションの文脈で3Dおよび4D画像データにうまく対処するのに役立ちます。最後に、この研究は脊椎動物の胚発生を教えることを容易にするための新しいツールも採用しています。
Introduction
脊椎動物の体軸形成は、胚発生中に起こる非常に複雑で動的なプロセスです。胃形成の終わりに[マウスでは、胚発生日(E)8.0頃]に、神経中胚葉前駆細胞(NMP)として知られるエピブラスト前駆細胞のグループが、頭から尾への配列における軸延長の重要な駆動因子となり、頸部、体幹および尾部形成中に神経管および近軸中胚葉系組織を生成する1、2、3、4.興味深いことに、これらのNMPが尾側エピブラストで占める位置は、中胚葉または神経外胚葉に分化する決定において重要な役割を果たしているようです5。現在、NMPの正確な分子指紋は得られていませんが、これらの細胞は一般にT(Brachyury)とSox2 5,6を共発現すると考えられています。NMPの運命決定を調節する正確なメカニズム(すなわち、それらが神経経路をとるか中胚葉経路をとるか)は、正確に定義され始めたばかりである。原始的な筋状領域におけるTbx6発現は、NMP運命決定の初期マーカーであり、この遺伝子は中胚葉6、7の誘導および仕様に関与している。興味深いことに、初期の中胚葉細胞は高レベルのEpha18を発現しているようであり、Wnt/β-カテニンシグナル伝達、ならびにMsgn1もまた、近軸中胚葉分化およびソマイト形成において重要な役割を果たすことが示された9,10。単一細胞レベルでのNMPの完全な空間時間解析は、中胚葉の仕様を制御する分子メカニズムを完全に理解するために確かに役立つでしょう。
ソマイト(椎骨前駆体)の形成は脊椎動物の重要な特徴である。軸方向の伸長の間、近軸中胚葉はソマイトとして知られる一連の両側反復単位でセグメント化される。ソマイトの数と新しいセグメントの形成に必要な時間は、種11、12によって異なります。ソミトジェネシスは、前嚢内胚葉(例えば、Lfng)におけるNotch、WntおよびFgfシグナル伝達経路のいくつかの遺伝子の周期的発現によって観察され得る周期的シグナル伝達振動(「セグメンテーションクロック」として知られている)11、12を含む。ソミトジェネシスの現在のモデルはまた、各新しいソマイトの後縁の位置を定義するFgf、Wntおよびレチノイン酸シグナル伝達を含む一連の複雑なシグナル伝達勾配である「成熟波面」の存在を仮定する。したがって、「セグメンテーションクロック」と「成熟波面」との間の協調的な相互作用は、これらの重要な形態形成過程における摂動が胚致死性または先天性奇形(例えば、脊柱側弯症)の形成をもたらす可能性があるため、これらの椎骨前駆体モジュールの生成にとって基本的である13,14,15。
画像化技術、バイオイメージ解析方法およびソフトウェアにおける最近の大幅な進歩にもかかわらず、軸方向の伸長およびソミトジェネシスのほとんどの研究は、依然として単一/単離された2次元画像データ(例えば、切片)に依存しており、完全な多次元組織可視化を可能とせず、病理学的奇形(すなわち、突然変異による)と胚発生中に起こる正常な形態学的変化との間の明確な区別を複雑にする16。.3Dでのイメージングは、以前は標準的な2D法では同定されていなかった新しい形態形成運動をすでに明らかにしており17,18,19,20、脊椎動物のソミトジェネシスおよび軸方向拡張のメカニズムを理解するためのin totoイメージングの力を強調している。
マウス胚の3Dおよび4D顕微鏡、特にライブイメージングは技術的に困難であり、正確で意味のある時空間分析を可能にするために、サンプル調製、画像取得、およびデータ前処理中に重要なステップが必要です。ここでは、マウス胚のライブイメージングおよびホールマウント免疫蛍光染色のための詳細なプロトコールについて述べ、軸延長およびセグメンテーション中にNMPおよび中胚葉系細胞の両方を研究するために使用することができる。さらに、我々はまた、トトにおける3D可視化および染色体形成中の問題(例えば、骨癒合および脊柱側弯症)に起因する病理学的異常の定量化を可能にする、高齢胚および胎児の光投影断層撮影(OPT)のためのプロトコルについても記述する13,21,22。最後に、脊椎動物のセグメンテーションと軸方向の伸びの研究と教育における3Dイメージング再構成の力を示します。
Protocol
Representative Results
Discussion
軸方向の伸長とセグメンテーションは、脊椎動物の胚発生中に起こる最も複雑で動的なプロセスの2つです。単一細胞追跡を伴う3Dおよび4Dイメージングの使用は、しばらくの間、ゼブラフィッシュおよびニワトリ胚の両方においてこれらのプロセスを研究するために適用されており、そのためにアクセス可能性および培養条件が複雑なイメージングを容易にする19、44、45、46…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
LuVeLuレポーター株のオリビエ・プルキエとアレクサンダー・オーレフラ、RapiClearテストサンプルのSunJin研究所、BigStitcherを使用した支援のHugo Pereira、ライブイメージング装置のセットアップを支援してくれたNuno Granjeiro、IGC動物施設、およびこの作業の過程で有益なコメントとサポートを提供してくれたMalloラボの過去および現在のメンバーに感謝します。
我々は、ポルトガル2020年パートナーシップ協定に基づき、欧州地域開発基金(FEDER)及びFundação para a Ciência e a Tecnologia(FCT, Portugal)を通じて、リスボン地域運用プログラム(Lisboa 2020)が共同出資する、ポルトガルの資金提供 ref# PPBI-POCI-01-0145-FEDER-022122及びref# PTDC/BII-BTI/32375/2017の支援を受けているIGCの先進イメージングファシリティの技術支援に感謝する。この原稿に記載されている研究は、研究インフラCongento、プロジェクトLISBOA-01-0145-FEDER-030254(FCT、ポルトガル)およびSCML-MC-60-2014(サンタカーサダミゼリコルディア、ポルトガル)に助成金を支給し、M.M、研究インフラCongento、プロジェクトLISBOA-01-0145-FEDER-022170、およびPhDフェローシップPD/BD/128426/2017からADへの助成金によって支援されました。
Materials
| Agarose low gelling temperature | Sigma | A9414 | Used to mounting embryos (e.g. for OPT) |
| Amira software | Thermofisher | – | Commerial software tool |
| Anti-Brachyury (Goat polyclonal) | R and D Systems | AF2085 RRID:AB_2200235 | For immunofluorescence |
| Anti-Sox2 (Rabbit monoclonal) | Abcam | ab92494 RRID:AB_10585428 | For immunofluorescence |
| Anti-Tbx6 (Goat polyclonal) | R and D Systems | AF4744 RRID:AB_2200834 | For immunofluorescence |
| Anti-Laminin111 (Rabbit polyclonal) | Sigma | L9393 RRID:AB_477163 | For immunofluorescence |
| Anti-goat 488 (Donkey polyclonal) | Molecular Probes | A11055 RRID:AB_2534102 | For immunofluorescence |
| Anti-rabbit 568 (Donkey polyclonal) | ThermoFisher Scientific | A10042 RRID:AB_2534017 | For immunofluorescence |
| Benzyl Alcohol (99+%) | (any) | – | Used to clear embryos (component of BABB) |
| Benzyl Benzoate (99+%) | (any) | – | Used to clear embryos (component of BABB) |
| Bovine serum albumin | Biowest | P6154 | For immunofluorescence |
| Coverglass 20×20 mm #0 | (any) | – | 100um thick |
| Coverglass 20×20 mm #1 | (any) | – | 170um thick |
| Coverglass 20×60 mm #1.5 | (any) | – | To use as “slides” |
| DAPI (4’,6-Diamidino-2- Phenylindole Dihydrochloride) | Life Technologies | D3571 | For immunofluorescence |
| Drishti software | (open source) | – | Free software tool |
| EDTA | Sigma | ED2SS | For demineralization |
| Fiji/ImageJ software | (open source) | – | Free software tool |
| Glycine | NZYtech | MB01401 | For immunofluorescence |
| Huygens software | Scientific Volume Imaging | – | Commerial software tool |
| HyClone defined fetal bovine serum | GE Healthcare | #HYCLSH30070.03 | For live imaging |
| Hydrogen peroxide solution 30 % | Milipore | 1085971000 | For clearing |
| Imaris software | Bitplane / Oxford instruments | – | Commerial software tool |
| iSpacers | SunJin Lab | (varies) | Use as spacers for preparations |
| L-glutamine | Gibco | #25030–024 | For live imaging medium |
| Low glucose DMEM | Gibco | 11054020 | For live imaging medium |
| M2 medium | Sigma | M7167 | To dissect embryos |
| Methanol | VWR | VWRC20847.307 | For dehydration and rehydration steps |
| Methyl salicylate | Sigma | M6752 | Used to clear embryos |
| Paraformaldehyde | Sigma | P6148 | Used in solution to fix embryos |
| Penicillin-streptomycin | Sigma | #P0781 | For live imaging medium |
| PBS (Phosphate-buffered saline solution) | Biowest | L0615-500 | – |
| RapiClear | SunJin Laboratory | RapiClear 1.52 | Used to clear embryos |
| Secure-Sea hybridization chambers | Sigma | C5474 | Use as spacers for preparations |
| simLab software | SimLab soft | – | Commerial software tool |
| Slide, depression concave glass – 75×25 mm | (any) | – | To mount thick embryos. |
| Triton X-100 | Sigma | T8787 | For immunofluorescence |
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