Метод культуры для поддержания тихие человеческие гематопоэтические стволовые клетки

Протокол соответствует руководящим принципам Национального центра глобального здравоохранения и медицины. Все экспериментальные процедуры, выполняемые на мышах, одобрены Национальным центром глобального здравоохранения и медицины животных экспериментального комитета.ПРИМЕЧАНИЕ: Обзор протокола проиллюстрирован на рисунке 1. 1. Липидная подготовка Растворить следующие липиды в метаноле в стеклянных трубках при указанных концентрациях: пальмитат натрия, 16 мг/мл; олеат натрия, 30 мг/мл; и холестерин, 4 мг/мл. Храните липидный раствор при -30 градусов по Цельсию и оттаивать образец перед использованием. Смешайте липидные растворы, приготовленные в шаге 1.1 в свежей стеклянной трубке в дозах, необходимых для получения окончательной концентрации 100 мкг/мл пальмитата, 100 мкг/мл олеата и 20 мкг/мл холестерина. Например, при подготовке 10 мл культурных средств массовой информации, смешать 62,5 мл пальмового раствора, 33 йл раствора олеата, и 50 мкл холестерина раствора в стеклянной трубке. Испарить метанол, передав азотный газ через липидный раствор(рисунок 2A и 2B). Если азотный газ недоступен, пройдите через раствор с помощью пипетки-помощи. Полностью испарить оставшийся метанол, нагревая стеклянную трубку в водяной бане при 37 градусов по Цельсию(рисунок 2C).ПРИМЕЧАНИЕ: Использование высокой концентрации газа N2 в ограниченном пространстве потенциально вредно. Хотя объем, используемый в протоколе для испарения метанола, ограничен и, таким образом, считается безопасным, проветривание помещения надлежащим образом и маркировка областей потенциально высоких концентраций газа N2 имеет важное значение в случае неожиданной утечки газа. 2. Средняя подготовка Подготовка Dulbecco модифицированных Eagle среды (DMEM)/F12 среды (с HEPES и глутамина). Добавьте пенициллин и стрептомицин сульфат к средней до конечной концентрации 50 единиц и 50 мкг/мл, соответственно. DMEM/F12 средний, содержащий антибиотики могут храниться при 4 кк, по крайней мере 2 месяца. Добавьте 4% w/v из бычьего альбумина сыворотки (BSA) в модифицированную среду Орла Дулбекко (DMEM)/F12 (с HEPES и глутамином). Отрегулируйте рН среды до рН 7,4-7,8 с помощью раствора NaOH, как правило, до рН 7,6. Добавьте среду к стеклянной трубке, подготовленной в шаге 1. Для достижения решения с максимальной растворимости рекомендуется добавление 3-15 мл среды. Полностью растворить липиды с помощью звуковой (оптимальной: более 20 мин звуковой). После того, как BSA и липиды растворяются, образец должен храниться при -80 градусов по Цельсию и использоваться в течение 2 месяцев. Оттепель непосредственно перед использованием. Добавьте 1/1000 инсулина, трансферрина, натрия и этанола амина (ITS-X) смесь DMEM/F12. Фильтровать смешанную среду с помощью фильтра 0,22 мкм (обозначенного как “культурные медиа”). Перед использованием добавьте фактор стволовых клеток человека (SCF) и тромбопоэтин человека (TPO) в культурные средства массовой информации при конечной концентрации 3 нг/мл каждый. После добавления цитокинов и ITS-X среда не может храниться. Окрашивание буфера: Добавить 10% FCS к Ca- и Mg-бесплатный фосфат буферный солевой раствор (PBS). Это решение может храниться при 4 градусах Цельсия в течение 2 недель. Оттепель СМИ: Добавить 10% FCS к DMEM/F12. Это решение является одноразовым. Цитокиный фондовый раствор: Растворите каждый человеческий SCF или человека TPO в PBS (Ca- и Mg-free) при 20 мкг/мл. Это решение может храниться при -80 градусов по Цельсию, по крайней мере один год без потери активности. После оттаивания храните раствор бульона при 4 градусах Цельсия и используйте в течение 1 месяца.ПРИМЕЧАНИЕ: Изучите много после каждой покупки, чтобы избежать изменений в загрязняющих веществ в BSA. Культура HSCs в то же время с различными партиями BSA и изучить фенотипические HSC номер на день 7, как описано ниже. Если пакет BSA показывает низкое количество или частоту клеток CD34 (например, менее половины числа входных ячеек), избегайте использования этой партии. 3. Подготовка костного мозга человека CD34 Приобрети человеческие CD34и клетки костного мозга и храните клетки в жидком азоте до их использования. Кроме того, клетки костного мозга из здоровых добровольцев или свежих клеток пуповинной крови могут быть использованы после одобрения институтом этического комитета и согласия донора. Теплый 10 мл оттаивания средств массовой информации в 15 мл конической трубки в 37 градусов по Цельсию водяной бане. Оттепель замороженных клеток во флаконах в 37 градусов по Цельсию водяной бане в течение 2 минут. После вытирания флакона 70% этанола для удаления загрязняющих веществ, перенесите клетки в коническую трубку 15 мл, содержащую предварительно разогретую среду от шага 3.2. Центрифуга 15 мл трубки при температуре 200 × в течение 15 минут при комнатной температуре. Аспирировать супернатант тщательно, чтобы сохранить гранулы нетронутыми (оставляя < 50 мкл среды). Переусердуйте клетки с оставшейся средой и перенесите их в трубку 1,5 мл на льду.ПРИМЕЧАНИЕ: Воздействие образцов, полученных человеком непосредственно в слизистой оболочке, включая глаз или раневых тканей может вызвать инфекцию известных или неизвестных патогенов; таким образом, перчатки и очки рекомендуется при обработке человеческих клеток. Даже если приобретенные клетки CD34и клетки тест отрицательный на вирус гепатита В (HBV), вирус гепатита С (ВГС) и вирус иммунодефицита человека 1 (HIV1), тщательный мониторинг должен быть проведен в соответствии с институциональными руководящими принципами, если происходит заболеваемость воздействием. Следуйте институциональным руководящим принципам при утилизации материалов, подвергшихся воздействию клеток человека. 4. Сортировка HSCs Этикетка клеток с фторхром-конъюгированных антител. Смешайте 50 л буфера окрашивания плюс 10 л анти-CD34-FITC, 2 л анти-CD38-PerCP-Cy5.5, 5 л анти-CD90-PE-Cy7 и 10 л анти-CD45RA-PE. Повторное использование клеточных гранул в смеси антител. Инкубировать клетки в течение 30 мин при 4 градусов по Цельсию в темноте. Добавьте 1 мл буфера окрашивания для мытья антител. Центрифуга труб при 340 градусах × в течение 5 мин при 4 градусах Цельсия. Отбросьте супернатант. Повторное увеличение клеточной гранулы в 0,5 мл буфера окрашивания и 0,1% йодида пропидия. Перенесите подвеску в трубку 5 мл с помощью 40 мкм фильтра. Ворота фенотипических HSCs в пределахPI – CD34иCD38 – CD90иCD45RA – фракцияс использованием FACS Aria-IIIu и сортировать клетки в 1,5 мл трубки заполнены 500 йл культурных средств массовой информации (Рисунок 3). Используя стратегию gating, показанную на рисунке 3,10% клеток CD34, как ожидается, будут фенотипическими HSCs. Запикайте отсортированное число ячеек для расчета объема мультимедиа для повторного перерасхода ячеек в шаге 5.3.ПРИМЕЧАНИЕ: Gating стратегия выполняется, как описано ранее16 при опуская линии маркера окрашивания с учетом низкого выражения маркеров линии в CD34-CD38- фракция от здоровыхлюдей 17 . Центрифуга отсортированных клеток при 340 × в течение 5 мин при 4 градусов по Цельсию и отбросить супернатант. Тщательно аспирировать супернатант, чтобы гарантировать, что гранулы остаются нетронутыми. Храните отсортированную клетку на льду до культуры.ПРИМЕЧАНИЕ: Во время первого эксперимента должна быть выполнена компенсация флуоресценции спектрального перекрытия. 5. Культура клеток Передача 200 МКЛ культурных средств массовой информации, содержащих цитокины, подготовленные в шаге 2 в плоский нижний 96-хорошо пластин. Чтобы избежать испарения среды, заполните все неиспользованные скважины 100-200 МЛ PBS. Повторное сортировка отсортированных ГКС в культурных средах без цитокинов на уровне 60 клеток/ОЛ. Aliquot 600 HSCs/well (10 МКЛ клеточной подвески) в каждую колодец. Номер ячейки может быть изменен. Менее 300 клеток приведет к большим техническим изменениям, и, таким образом, для обнаружения биологических различий требуется больше скважин в единицу состояния. Культивирования более 1000 клеток в одной колодец следует избегать из-за лишения цитокинов/питательных веществ или накопления неблагоприятных цитокинов/хемокиных. Культура клеток в увлажненные мульти-газового инкубатора при 37 градусов по Цельсию в 5% CO2 и 1% O2 атмосферы. Для культур старше 7 дней рекомендуется заменить половину объема мультимедиа каждые 3-4 дня. Тщательно аспирировать 100 йл средств массовой информации путем трубопроводов и добавить 100 йл вновь подготовленных средств культуры, содержащих цитокины к каждой хорошо. Культурные средства массовой информации должны быть предварительно разогреты при 37 градусов по Цельсию. 6. Анализ маркерных фенотипов с использованием цитометрии потока ПРИМЕЧАНИЕ: Хотя клетки должны быть проанализированы после 7 дней культуры, продолжительность культуры может быть изменена. Отбросьте 170 МКЛ среды с помощью 8-канального пипетки. Этикетка клеток с антителами смеси. Смешайте 0,5 л анти-CD34-FITC, 0,1 л анти-CD38-PerCP-Cy5.5, 0,25 л анти-CD90-PE-Cy7, 0,5 л анти-CD45RA-PE и 9 йл окрашивания буфера на колодец. Добавьте 10 мкл смеси в пластину 96-колодец и инкубировать клетки в течение 30 мин при 4 градусах цельсия в темноте. Чтобы промыть антитела, добавьте 100 МКЛ буфера окрашивания в скважины и центрифуга пластин при 400 × г в течение 5 мин при 4 градусах Цельсия с использованием низкого ускорения и среднего замедления. Тщательно аспирировать 100 МКЛ супернатанта для поддержания клеток на дне скважин, затем повторно использовать клетки в 200 МКЛ окрашивания буфера 0,1% v/v PI и 1% v/v флуоресцентных микросфер (например, Flow-Check Fluorospheres). Настройка инструмента цитометрии потока. Получение данных для образцов в быстром режиме со смешанным режимом выборки и объемы поглощения 100 КЛ. Экспортируйте данные в формате FCS и анализируйте их с помощью программного обеспечения, такого как FlowJo. Номера клеток можно определить с помощью флуоресцентного количества шариков микросферы. Например, если исследователь добавляет 2000 бусинок на колодец, а количество шариков составляет 700, умножьте количество клеток каждой фракции на 2000/700, чтобы оценить общее количество клеток фракции в колодец.ПРИМЕЧАНИЕ: Флуоресцентные микросферы токсичны для культурных клеток из-за присутствия формальдегида. Это может привести к гибели клеток во время анализа. Свести к минимуму количество скважин (<50 скважин), анализируемых непрерывно, чтобы избежать смещения. 7. Трансплантация человеческих ГКС ПРИМЕЧАНИЕ: Активность перенаселения культурных клеток подтверждается трансплантацией иммунодефицитным мышам. Все процедуры должны быть одобрены комитетами по экспериментам на животных или их эквивалентами. В качестве доноров подготовь достаточное количество 8-12-недельных иммунодефицитных мышей NOD-SCID-Il2rg-null (NOG). Как NOG мышей очень восприимчивы к инфекции, держать размножения клетки как можно более чистыми и кормить мышей с стерилизованной диеты и воды. Культура достаточное количество HSCs для трансплантации, как описано в шаге 5. Например, когда 5000 HSCs (эквивалент дня 0) пересажены 6 мышам-реципиентам, культура 35,000-40,000 HSCs в 40 скважинах плиты 96-наилучшим образом (200 qL средств культуры в наилучшим образом) или в 8 скважинах плиты 24-наилучшим образом (1 mL средств культуры в наилучшим образом). Культура клеток в течение 2 недель с половиной медиа изменения каждые 3-4 дня в увлажненной мульти-газового инкубатора при 37 градусов по Цельсию с 5% CO2 и 1% O2. Продолжительность культуры может быть изменена. Облучение мышей NOG на 2,5 Г.г. при 6-24 ч до трансплантации. Соберите культурные HSCs в 1,5 мл труб. Центрифуга труб при 340 градусах ×в течение 5 мин при 4 градусов по Цельсию. Тщательно аспирировать супернатанты и повторно использовать клетки в стерильных ледяного окрашивания буфера при плотности клеток 5000 HSCs (день 0 эквивалент) на 200 йл. Передача этой подвески на 3 мл полипропиленные трубки. Чтобы стерилизовать буфер окрашивания, отфильтруйте его с помощью фильтра 0,22 мкм. Перед трансплантацией обезболивать мышей путем вдыхания севофлюрана или изофлюрана. Для пересадки 5000 культурных HSCs (эквивалент дня 0), ввиснуть 200 МКЛ клеточной подвески в хвостовую вену или ретро орбитальной пазухи мышей NOG облученных в шаге 7.1 с помощью 1 мл шприца и 27-го калибра иглы. Свежеиспеченные или размороженные ГКС костного мозга могут быть пересажены в качестве контроля. Перчатки должны быть стерилизованы с 70% V / V этанола между каждой процедурой. 8. Анализ частоты клеток, полученных человеком в периферической крови Чтобы изучить перенаселенность клеток человека, соберите периферическую кровь на 1, 2 и 3 месяца после трансплантации. Перед сбором периферической крови, анестезировать мышей путем вдыхания севофлюран. Соберите 40-80 МКЛ периферической крови из ретро-орбитальной пазухи с помощью гепаринизированных стеклянных капиллярных трубок и приостановите этот образец в 1 мл PBS и гепарин (1 U/mL) в трубах 1,5 мл. Центрифуга суспензии крови при 340 × в течение 3 мин при 4 градусах Цельсия. Откажитесь от супернатанта и повторно посовелайте гранулы в 1 мл PBS 1,2% ж/в декстран (200 кДа) в течение 45 мин при комнатной температуре. Перенесите супернатант еще на 1,5 мл трубки и центрифуги при 340 × в течение 3 мин. Для лиза красных кровяных телец, повторное течение клеток в 0,17 M NH4Cl в течение 5 мин. Центрифуга клеточной суспензии 340 × в течение 3 мин при 4 градусах Цельсия. Повторное посынище клетки в 50 МКЛ окрашивания буфера, содержащего 0,3 МЛ анти-мышь Fc-блок. Инкубация этого образца при 4 градусов по Цельсию в течение 5 мин. Добавьте следующие антитела для окрашивания поверхностных маркеров: 0,3 МЛ мыши CD45-PE-Cy7, мышь Ter-119-PE-Cy7, 0,3 МЛ человека CD45-BV421, 0,3 МЛ человека CD13-PE, 1,2 МЛ человека CD33-PE, 0,3 МЛ человека CD19-APC, 0,3 мл человека CD3-APC-Cy7. Инкубировать клетки при 4 градусов по Цельсию в течение 15 мин. Вымойте один раз с 1 мл окрашивания буфера и центрифуги при 340 × в течение 5 мин при 4 градусов по Цельсию. Отбросьте супернатант и ассизент клетки в 200 йл окрашивания буфера 0,1% V / V PI. Перенесите подвеску ячейки на 96-хорошо плоскую нижнюю пластину и приобретайте данные с помощью цитометра потока в быстром режиме с режимом образца смеси и объемом поглощения 100 йл. Экспорт данных в формате FCS для анализа с использованием программного обеспечения, такого как FlowJo. Настройка цитометра потока. Приобретайте данные для образцов в быстром режиме с режимом образца смеси и объемом поглощения 100 йл. Экспорт данных в формате FCS для анализа с использованием программного обеспечения, такого как FlowJo.