Este protocolo permite a manutenção de células-tronco hematopoiéticas humanas quiescentes in vitro, imitando o microambiente de medula óssea usando ácidos graxos abundantes, colesterol, menores concentrações de citocinas e hipóxia.
Células-tronco hematopoiéticas humanas (HSCs), como outros HSCs mamíferos, mantêm hematopoiese ao longo da vida na medula óssea. Os HSCs permanecem quiescentes in vivo, ao contrário de progenitores mais diferenciados, e entram no ciclo celular rapidamente após quimioterapia ou irradiação para tratar lesão de medula óssea ou cultura in vitro. Ao imitar o microambiente da medula óssea na presença de ácidos graxos abundantes, colesterol, baixa concentração de citocinas e hipóxia, os HSCs humanos mantêm quiescência in vitro. Aqui, é descrito um protocolo detalhado para a manutenção de HSCs funcionais no estado quiescente in vitro. Este método permitirá estudos sobre o comportamento dos HSCs humanos em condições fisiológicas.
Células-tronco hematopoiéticas (HSCs) e células progenitoras multipotentes (MPPs) formam coordenadamente um reservatório para reposição contínua de células diferenciadas para manter hematopoiese ao longo da vida em humanos1. A quiescência do ciclo celular é uma característica proeminente dos HSCs, diferenciando-os dos MPPs2. Convencionalmente, acredita-se que os HSCs residam no ápice da hierarquia do sistema hematopoiético, produzindo todas as células sanguíneas diferenciadas. Este modelo hierárquico foi deduzido principalmente a partir de experimentos de transplante3. No entanto, estudos recentes indicaram que a dinâmica dos HSCs difere in vivo em relação às dos experimentos de transplante4,5,6,7. Experimentos de rastreamento de linhagem usando vários sistemas de codificação de barras revelaram que os HSCs de murina murina fenotípica não são um tipo de célula única que contribui para hematopoiese de estado estável, e MPPs, que exibem atividade limitada de auto-renovação nas configurações de transplante, fornecem continuamente células sanguíneas maduras4,5,8. Em contrapartida, a contribuição dos HSCs para as células maduras é aumentada após a lesão da medula óssea4. Isso pode ser atribuído a alterações drásticas no microambiente após a ablação da medula óssea, incluindo o transplante de medula óssea. Embora a aplicação do rastreamento de linhagem de células murinas em células humanas seja difícil, a análise filogenética que combina o isolamento de colônias derivadas de células únicas e o sequenciamento de genomas inteiros revelaram uma propriedade semelhante do sistema hematopoiético, no qual tanto os HSCs quanto os MPPs são responsáveis pela produção diária de células maduras7. Assim, embora o transplante seja essencial para examinar a atividade murina ou humana do HSC, outros modelos experimentais são necessários para entender os comportamentos dos HSCs em condições fisiológicas.
Métodos de cultivo para HSCs têm sido estudados detalhadamente para entender suas aplicações e características clínicas. Os HSCs humanos podem ser expandidos in vitro usando uma combinação de citocinas, reconstituição de matrizes extracelulares, remoção de antagonistas de auto-renovação, cocultura com células mesenquimais ou endoteliais, adição de albumina ou sua substituição, transdução de fatores de transcrição de autocon renovação e adição de compostos de pequenas moléculas9,10. Alguns desses métodos, incluindo a adição de pequenos compostos SR111 e UM17112,foram testados em ensaios clínicos com resultados promissores9. Considerando a natureza quiescente dos HSCs in vivo, manter HSCs com ciclo de células mínimas é fundamental para recapitular o comportamento do HSC in vitro. HSCs quiescentes e proliferadores apresentam entrada diferencial do ciclo celular13, estado metabólico14e tolerância contra múltiplas tensões15 . Os métodos utilizados para manter a quiescência dos HSCs humanos in vitro são limitados.
Ao imitar o microambiente da medula óssea (hipóxica e rica em lipídios) e otimizar a concentração de citocinas, os HSCs humanos podem ser mantidos indiferenciados e quiescentes sob a cultura. Recapitulando a natureza quiescente dos HSCs in vitro melhorará a compreensão das propriedades estatais estáveis dos HSCs e permitirá a manipulação experimental dos HSCs.
Recentemente, vários métodos de expansão de HSCs com diferenciação mínima foram relatados18,19,20,21. Embora esses métodos sejam excelentes, os HSCs são forçados a ativar seus ciclos celulares na presença de altos níveis de citocinas, o que difere da situação in vivo em que os HSCs apresentam ciclos mínimos. Este protocolo é útil para manter os HSCs como quiescentes, como observado in vivo, recapitulando o microambiente da medula óssea.
Ao cultivar HSCs humanos sob condições de citocinas baixas, ricas em lipídios e hipoxicas, os HSCs mostraram ciclismo mínimo enquanto mantinham seus fenótipos marcadores. O passo crítico neste protocolo é a preparação de meio contendo alta concentração de ácidos graxos e colesterol e baixas concentrações de citocinas e cultura sob hipóxia (Passo 1, Passo 2 e Passo 4). Sem colesterol e/ou ácidos graxos, a taxa de manutenção dos HSCs sob baixas concentrações de citocinas diminui22. A colheita de células em condições hipóxiis também é importante, como relatado anteriormente23.
As condições de cultura foram semelhantes às utilizadas para HSCs murinas, com exceção das concentrações de citocinas. Os HSCs murine sobrevivem sem TPO, enquanto os HSCs humanos requerem pelo menos 2 ng/mL de TPO com 3 ng/mL de SCF22. Como a concentração de TPO é muito maior do que a do soro humano (~100 pg/mL), as condições utilizadas neste protocolo podem estar faltandofatores específicos para apoiar a sobrevivência dos HSCs humanos. A adição de seu ligante FLT3LG diminui ligeiramente a exigência de TPO para manter os HSCs22.
Os HSCs humanos requerem maiores concentrações de colesterol em comparação com os HSCs murine, presumivelmente devido à incapacidade de induzir a expressão de enzimas sintetizadoras de colesterol e suscetibilidade à lipotoxicidade sob altas concentrações (>400 μg/mL) de ácidos graxos22. Embora apenas a combinação de ácidos palmíticos, oleicos, linóricos e esteáricos tenha sido testada, que são abundantemente encontradas no soro humano, outras combinações de lipídios devem ser avaliadas para reduzir a lipotoxicidade e melhorar a taxa de manutenção de HSCs funcionais.
Embora a atividade de repopulação de HSCs humanos cultivados em camundongos imunodeficientes após duas semanas de cultura tenha sido confirmada22, este sistema de cultura não recapitula totalmente as funções de nicho dos HSCs in vivo. A expressão do CD45RA foi relatada para aumentar e a capacidade de repopulação é inferior à dos HSCs22recém-classificados . No entanto, as concentrações de nutrientes, como glicose, aminoácido, piruvato e insulina, que são adicionados ao meio em níveis suprafisiológicos, podem ser otimizadas. Contaminantes na BSA também podem comprometer a manutenção dos HSCs18,25. Além disso, algumas células cultivadas sofrem morte celular, enquanto outras passam por divisão celular; assim, a manutenção do número total da célula pode não indicar o estado quiescente de cada célula.
Apesar dessas limitações, as condições de cultura descritas no protocolo desenvolvido neste estudo ajudarão a avançar na pesquisa e engenharia dos HSCs, particularmente em condições quase fisiológicas. Condições culturais que mantenham HSCs com mínima diferenciação e atividade ciclística seriam adequadas para testar compostos biológicos e químicos que atuam especificamente em HSCs, manipulando HSCs via transdução de lentivírus ou edição de genomas sem a perda de caule, e elucidando o passo inicial de transformação induzido por genes associados à leucemia.
The authors have nothing to disclose.
Agradecemos a M. Haraguchi e S. Tamaki pelo apoio técnico e gestão de laboratório e K. Shiroshita por tirar fotos. O HK foi apoiado em parte pelo KakenHI Grant da MEXT/JSPS (bolsa nº 19K17847) e pelo Centro Nacional de Saúde e Medicina Global. A KT foi apoiada em parte por subvenções kakenhi da MEXT/JSPS (subvenção nº 18H02845 e 18K19570), National Center for Global Health and Medicine (grant nos 26-001 e 19A2002), AMED (grant nos. JP18ck0106444, JP18ae0201014 e JP20bm0704042), Ono Medical Research Foundation, Kanzawa Medical Research Foundation e Takeda Science Foundation.
Human bone marrow CD34+ progenitor cells | Lonza | 2M-101C | |
NOD/Shi-scid,IL-2RγKO Jic | In-Vivo Science Inc. | https://www.invivoscience.com/en/nog_mouse.html | |
Anti-human CD34-FITC (clone: 581) | BD biosciences | Cat# 560942; RRID: AB_10562559 | |
Anti-human CD38-PerCP-Cy5.5 | BD biosciences | Cat# 551400; RRID: AB_394184 | |
Anti-human CD45RA-PE | BD biosciences | Cat# 555489; RRID: AB_395880 | |
Anti-human CD90-PE-Cy7 (clone: 5E10) | BD biosciences | Cat# 561558; RRID: AB_10714644 | |
Anti-human CD13-PE (clone: WM15) | BioLegend | Cat# 301703; RRID: AB_314179 | |
Anti-human CD33-PE (clone: WM53) | BD biosciences | Cat# 561816; RRID: AB_10896480 | |
Anti-human CD19-APC (clone: SJ259) | BioLegend | Cat# 363005; RRID: AB_2564127 | |
Anti-human CD3-APC-Cy7 (clone: SK7) | BD biosciences | Cat# 561800; RRID: AB_10895381 | |
Anti-human CD45-BV421 (clone: HI30) | BD biosciences | Cat# 563880; RRID:AB_2744402 | |
Anti-mouse CD45-PE-Cy7 (clone: 30-F11) | BioLegend | Cat# 103114; RRID: AB_312979 | |
Anti-mouse Ter-119-PE-Cy7 (clone: TER-119) | BD biosciences | Cat# 557853; RRID: AB_396898 | |
Fc-block (anti-mouse CD16/32) (clone: 2.4-G2) | BD Biosciences | Cat# 553142; RRID: AB_394657 | |
Phosphate buffered saline | Nacalai Tesque | Cat# 14249-24 | |
Fetal bovine serum | Thermo Fisher Scientific | Cat# 26140079 | |
DMEM/F-12 medium | Thermo Fisher Scientific | Cat# 11320-033 | |
ITS-X | Thermo Fisher Scientific | Cat# 51500056 | |
Penicillin | Meiji Seika | PGLD755 | |
Streptomycin sulfate | Meiji Seika | SSDN1013 | |
Bovine serum albumin | Sigma Aldrich | Cat# A4503 | |
Sodium palmitate | Tokyo Chemical Industry Co., Ltd. | Cat# P0007 | |
Sodium oleate | Tokyo Chemical Industry Co., Ltd. | Cat# O0057 | |
Cholesterol | Tokyo Chemical Industry Co., Ltd. | Cat# C0318 | |
Ammonium Chloride | Fujifilm | Cat# 017-2995 | |
Sodium Hydrogen Carbonate | Fujifilm | Cat# 191-01305 | |
EDTA・2Na | Fujifilm | Cat# 345-01865 | |
Heparine Na | MOCHIDA PHARMACEUTICAL CO., LTD. | Cat# 224122557 | |
Sevoflurane | Fujifilm | Cat# 193-17791 | |
Dextran | Nacalai Tesque | Cat# 10927-54 | |
Recombinant Human SCF | PeproTech | Cat# 300-07 | |
Recombinant Human TPO | PeproTech | Cat# 300-18 | |
Recombinant human Flt3 ligand | PeproTech | Cat# 300-19 | |
Propidium iodide | Life Technologies | Cat# P3566 | |
Flow-Check Fluorospheres | Beckman Coulter | Cat# 7547053 | |
FlowJo version 10 | BD Biosciences | https://www.flowjo.com/solutions/flowjo | |
AutoMACS Pro | Miltenyi Biotec | N/A | |
FACS Aria3u | BD Biosciences | N/A | |
VELVO-CLEAR VS-25 (sonicator) | VELVO-CLEAR | N/A | |
Nitrogen gas cylinder | KOIKE SANSHO CO., LTD | N/A | |
Gas regulator | Astec | Cat# IM-055 | |
Multigas incubator | Astec | Cat# SMA-30DR | |
Glass tube, 16 mL | Maruemu corporation | N-16 | |
Glass tube, 50 mL | Maruemu corporation | NX-50 | |
Millex-GP Syringe Filter Unit, 0.22 µm, polyethersulfone, 33 mm, gamma sterilized | Merck Millipore | SLGPR33RS |