Eine Kulturmethode zur Erhaltung von quiescent Human Hematopoietic Stammzellen

Das Protokoll folgt den Richtlinien des National Center for Global Health and Medicine. Alle experimentellen Verfahren an Mäusen werden vom National Center for Global Health and Medicine Animal Experiment Committee genehmigt.ANMERKUNG: Eine Übersicht über das Protokoll ist in Abbildung 1dargestellt. 1. Lipidzubereitung Die folgenden Lipide in Methanol in Glasröhren bei den angegebenen Konzentrationen auflösen: Natriumpalmitat, 16 mg/ml; Natriumoleat, 30 mg/ml; und Cholesterin, 4 mg/ml. Die Lipidlösung bei -30 °C aufbewahren und die Probe vor Gebrauch auftauen. Mischen Sie die in Schritt 1.1 hergestellten Lipidlösungen in einem frischen Glasrohr in den Dosen, die erforderlich sind, um die Endkonzentration von 100 g/ml Palmitat, 100 g/ml Oleat und 20 g/ml-Cholesterin zu erhalten. Zum Beispiel, bei der Vorbereitung von 10 ml Kulturmedien, mischen Sie 62,5 l Palmitat-Lösung, 33 l Oleat-Lösung, und 50 l Cholesterin-Lösung in der Glasröhre. Verdampfen Sie das Methanol, indem Sie Stickstoffgas durch die Lipidlösung passieren (Abbildung 2A und 2B). Wenn kein Stickstoffgas verfügbar ist, leiten Sie die Luft mit hilfe einer Pipettenhilfe durch die Lösung. Das restliche Methanol vollständig verdampfen, indem sie das Glasrohr in einem Wasserbad bei 37 °C erhitzen (Abbildung 2C).HINWEIS: Die Verwendung einer hohen Konzentration vonN2-Gas auf engstem Raum ist potenziell schädlich. Obwohl das im Protokoll zur Verdunstung von Methanol verwendete Volumen begrenzt ist und daher als sicher gilt, ist eine ausreichende Belüftung des Raumes und die Kennzeichnung von Bereichen mit potenziell hohen Konzentrationen vonN2-Gas wichtig, falls ein unerwartetes Gasleck auftritt. 2. Mittlere Vorbereitung Bereiten Sie Dulbeccos modifiziertes Eagle Medium (DMEM)/F12 medium (mit HEPES und Glutamin) vor. Penicillin und Streptomycinsulfat in das Medium eintragen und die Endkonzentration von 50 Einheiten bzw. 50 g/ml erreichen. DMEM/F12-mittelhaltige Antibiotika können mindestens 2 Monate bei 4 °C gelagert werden. Fügen Sie 4% w/v Rinderserumalbumin (BSA) zu Dulbeccos modifiziertem Eagle Medium (DMEM)/F12 medium (mit HEPES und Glutamin) hinzu. Stellen Sie den pH-Wert des Mediums auf pH 7.4-7.8 mit NaOH-Lösung ein, typischerweise auf pH 7,6. Fügen Sie das Medium in Schritt 1 auf das in Schritt 1 vorbereitete Glasrohr ein. Um eine Lösung mit maximaler Löslichkeit zu erreichen, wird die Zugabe von 3-15 ml Medium empfohlen. Vollständig lösen die Lipide durch Beschallung (optimal: mehr als 20 min Beschallung). Nachdem die BSA und lipide gelöst sind, sollte die Probe bei -80 °C gelagert und innerhalb von 2 Monaten verwendet werden. Unmittelbar vor Gebrauch auftauen. 1/1.000 des Insulin-, Transferrin-, Natriumselenit- und Ethanolamin-Gemischs (ITS-X) in das DMEM/F12 geben. Filtern Sie das Mischmedium mit einem 0,22 m-Filter (als “Kulturmedium” bezeichnet). Vor der Anwendung fügen Sie den Kulturmedien mit einer Endkonzentration von jeweils 3 ng/ml den menschlichen Stammzellfaktor (SCF) und humanes Thrombopoietin (TPO) hinzu. Nach dem Hinzufügen der Zytokine und ITS-X kann das Medium nicht gespeichert werden. Färbepuffer: Fügen Sie Ca- und Mg-freier Phosphat-gepufferter Saline (PBS) 10% FCS hinzu. Diese Lösung kann bei 4 °C für 2 Wochen gelagert werden. Auftauen von Medien: Fügen Sie dem DMEM/F12 10% FCS hinzu. Diese Lösung ist einsam. Cytokin-Stammlösung: Lösen Sie jeden menschlichen SCF oder menschlichen TPO in PBS (Ca- und Mg-frei) bei 20 g/ml. Diese Lösung kann bei -80 °C für mindestens ein Jahr ohne Aktivitätsverlust gelagert werden. Nach dem Auftauen die Lagerlösung bei 4 °C aufbewahren und innerhalb von 1 Monat verwenden.HINWEIS: Untersuchen Sie das Los nach jedem Kauf, um Abweichungen in den Verunreinigungen in BSA zu vermeiden. Kultur HSCs zur gleichen Zeit mit verschiedenen Chargen von BSA und untersuchen Sie die phänotypische HSC-Nummer an Tag 7, wie unten beschrieben. Wenn ein BSA-Batch eine geringe Anzahl oder Häufigkeit von CD34+-Zellen anzeigt (z. B. weniger als die Hälfte der Anzahl der Eingabezellen), vermeiden Sie die Verwendung dieses Batches. 3. Herstellung des menschlichen Knochenmarks CD34+ Zellen Kaufen Sie menschliche CD34+ Knochenmarkzellen und speichern Sie die Zellen in flüssigem Stickstoff bis zur Verwendung. Alternativ können Knochenmarkzellen aus einem gesunden Freiwilligen oder frischen Nabelschnurblutzellen nach Genehmigung durch die Ethikkommission des Instituts und der Zustimmung des Spenders verwendet werden. Erwärmen Sie 10 ml Auftaumedien in einem 15 ml konischen Rohr in einem 37 °C Wasserbad. Die gefrorenen Zellen in Fläschchen in einem 37 °C-Wasserbad innerhalb von 2 min auftauen. Nach dem Abwischen der Durchstechflasche mit 70% Ethanol zur Entfernung von Verunreinigungen, übertragen Sie die Zellen in das 15 ml konische Rohr, das das vorgewärmte Medium aus Schritt 3.2 enthält. Zentrifugieren Sie das 15 ml-Rohr bei 200 × g für 15 min bei Raumtemperatur. Aspirieren Sie den Überstand sorgfältig, um das Pellet intakt zu halten (wobei < 50 l Medium). Setzen Sie die Zellen mit dem verbleibenden Medium wieder auf und übertragen Sie sie in eine 1,5 ml Röhre auf Eis.HINWEIS: Die Exposition gegenüber vom Menschen abgeleiteten Proben direkt in der Schleimhaut einschließlich des Auges oder des verwundeten Gewebes kann zu einer Infektion durch bekannte oder unbekannte Krankheitserreger führen; Daher werden Handschuhe und Brillen beim Umgang mit menschlichen Zellen empfohlen. Selbst wenn die gekauften CD34+ Zellen negativ auf Hepatitis-B-Virus (HBV), Hepatitis-C-Virus (HCV) und humanes Immundefizienzvirus 1 (HIV1) testen, sollte eine sorgfältige Überwachung gemäß den institutionellen Richtlinien durchgeführt werden, wenn eine Expositionsinzidenz auftritt. Befolgen Sie die institutionellen Richtlinien bei der Entsorgung von Materialien, die menschlichen Zellen ausgesetzt sind. 4. Sortieren von HSCs Beschriften Sie die Zellen mit fluorchromkonjugierten Antikörpern. Mischen Sie 50 l Desreinenpuffer plus 10 l Anti-CD34-FITC, 2 l Anti-CD38-PerCP-Cy5.5, 5 l Anti-CD90-PE-Cy7 und 10 l Anti-CD45RA-PE. Das Zellpellet in der Antikörpermischung wieder aufsetzen. Inkubieren Sie die Zellen 30 min bei 4 °C im Dunkeln. Fügen Sie 1 ml Färbepuffer hinzu, um die Antikörper zu waschen. Zentrifugieren Sie die Rohre bei 340 × g für 5 min bei 4 °C. Entsorgen Sie den Überstand. Setzen Sie das Zellpellet in 0,5 ml Färbepuffer + 0,1% Propidiumjodid wieder auf. Übertragen Sie die Suspension mit einem 40-ml-Filter in ein 5 ml-Rohr. Gate die phäotypische HSCs innerhalb der PI-CD34+CD38-CD90+CD45RA- Fraktion mit dem FACS Aria-IIIu und sortieren Sie die Zellen in eine 1,5 ml Rohr gefüllt mit 500 L Kulturmedien (Abbildung 3). Mit der in Abbildung 3gezeigten Gating-Strategie werden 10 % der CD34+ Zellen als phänotische HSCs erwartet. Zeichnen Sie die sortierte Zellennummer auf, um das Medienvolumen zu berechnen, um die Zellen in Schritt 5.3 wieder auszusetzen.HINWEIS: Die Gating-Strategie wird wie zuvorbeschrieben 16 durchgeführt, während die Linienmarkierungsfärbung unter Berücksichtigung des geringen Ausdrucks von Linienmarkierungen in der CD34+CD38-Fraktion von gesunden Personen17 weggelassen wird. Zentrifugieren Sie die sortierten Zellen bei 340 × g für 5 min bei 4 °C und entsorgen Sie den Überstand. Achten Sie sorgfältig auf den Überstand, um sicherzustellen, dass das Pellet intakt bleibt. Bewahren Sie die sortierten Zellen auf Eis bis zur Kultur auf.HINWEIS: Die Fluoreszenzkompensation der spektralen Überlappung sollte während des ersten Experiments durchgeführt werden. 5. Zellkultur Übertragen Sie 200 l der in Schritt 2 hergestellten Kulturmedien mit Zytokinen in flache 96-Well-Platten. Um eine Verdunstung des Mediums zu vermeiden, füllen Sie alle ungenutzten Brunnen mit 100-200 l PBS. Setzen Sie die sortierten HSCs in Kulturmedien ohne Zytokine bei 60 Zellen/L aus. Aliquot 600 HSCs/Well (10 l Zellsuspension) in jedem Brunnen. Die Zellennummer kann geändert werden. Weniger als 300 Zellen führen zu größeren technischen Schwankungen, und daher werden mehr Brunnen pro Zustand benötigt, um biologische Unterschiede zu erkennen. Das Kultivieren von mehr als 1000 Zellen in einem einzigen Brunnen sollte aufgrund von Zytokin/Nährstoffentzug oder anhäufenvon ungünstigen Zytokinen/Chemokinen vermieden werden. Die Zellen in einem befeuchteten Multigas-Inkubator bei 37 °C in einer 5%CO2 und 1%O2-Atmosphäre kulturieren. Für Kulturen über 7 Tage wird empfohlen, die Hälfte des Medienvolumens alle 3-4 Tage zu ersetzen. Saugen Sie sorgfältig 100 l Medien durch Pipettieren und fügen Sie jedem Brunnen 100 L neu hergestellte Kulturmedien hinzu, die Zytokine enthalten. Die Kulturmedien sollten bei 37 °C vorgewärmt werden. 6. Analyse von Marker-Phänotypen mittels Durchflusszytometrie HINWEIS: Obwohl die Zellen nach 7 Tagen Kultur analysiert werden sollten, kann die Kulturdauer geändert werden. Entsorgen Sie 170 l des Mediums mit einer 8-Kanal-Pipette. Beschriften Sie die Zellen mit der Antikörpermischung. Mischen Sie 0,5 l Anti-CD34-FITC, 0,1 l Anti-CD38-PerCP-Cy5,5, 0,25 l Anti-CD90-PE-Cy7, 0,5 l Anti-CD45RA-PE und 9 l Färbepuffer pro Bohrung. 10 L der Mischung in die 96-Well-Platte geben und die Zellen im Dunkeln 30 min bei 4 °C bebrüten. Um die Antikörper zu waschen, fügen Sie 100 l Färbepuffer in die Brunnen und zentrifugieren Sie die Platten bei 400 × g für 5 min bei 4 °C mit geringer Beschleunigung und mittlerer Verzögerung. Saugen Sie vorsichtig 100 l des Überstandes an, um die Zellen auf dem Boden der Brunnen zu erhalten, und suspendieren Sie dann die Zellen in 200 l Färbepuffer + 0,1 % v/v PI + 1% v/v fluoreszierender Mikrosphären (z. B. Flow-Check Fluorosphären). Richten Sie das Durchflusszytometrieinstrument ein. Erfassen Sie Daten für die Proben im schnellen Modus mit gemischtem Probenmodus auf und Aufnahmevolumina von 100 l. Exportieren Sie die Daten im FCS-Format und analysieren Sie sie mit Software wie FlowJo. Zellnummern können mit der fluoreszierenden Mikrosphärenperlenzahl bestimmt werden. Wenn der Forscher beispielsweise 2000 Perlen pro Brunnen hinzufügt und die Perlenzahl 700 beträgt, multiplizieren Sie die Zellzahl jedes Bruchs mit 2000/700, um die Gesamtzahl der Zellmenge im Brunnen zu schätzen.HINWEIS: Fluoreszierende Mikrosphären sind aufgrund des Vorhandenseins von Formaldehyd toxisch für kultivierte Zellen. Dies kann den Zelltod während der Analyse induzieren. Minimieren Sie die Anzahl der Bohrungen (<50 Brunnen), die kontinuierlich analysiert werden, um Verzerrungen zu vermeiden. 7. Transplantation menschlicher HSCs HINWEIS: Die Repopulation-Aktivität von kultivierten Zellen wird durch Transplantation an immundefizienten Mäusen validiert. Alle Verfahren müssen von Tierversuchsausschüssen oder deren Äquivalenten genehmigt werden. Als Spender bereiten Sie eine ausreichende Anzahl von 8-12-wöchigen immundefizienten NOD-SCID-Il2rg-null (NOG) Mäusen vor. Da NOG-Mäuse sehr anfällig für Infektionen sind, halten Sie die Zuchtkäfige so sauber wie möglich und füttern Sie die Mäuse mit einer sterilisierten Ernährung und Wasser. Kultur eine ausreichende Anzahl von HSCs für die Transplantation, wie in Schritt 5 beschrieben. Wenn beispielsweise 5000 HSCs (Tag 0-Äquivalent) an 6 Empfängermäuse transplantiert werden, kulturen Sie 35.000-40.000 HSCs in 40 Brunnen einer 96-Well-Platte (200 L Kulturmedien pro Brunnen) oder in 8 Brunnen einer 24-Well-Platte (1 ml Kulturmedien pro Brunnen). Kultur die Zellen für 2 Wochen mit Halbmedienveränderungen alle 3-4 Tage in einem befeuchteten Multigas-Inkubator bei 37 °C mit 5%CO2 und 1% O2. Die Kulturdauer kann geändert werden. Bestrahlen Sie NOG-Mäuse bei 2,5 Gy bei 6-24 h vor der Transplantation. Sammeln Sie die kultivierten HSCs in 1,5 ml Röhren. Zentrifugieren Sie die Rohre bei 340 ×g für 5 min bei 4°C. Die Überdringungsmittel vorsichtig ansaugen und die Zellen in sterilem eiskalten Färbepuffer bei einer Zelldichte von 5000 HSCs (Tag 0 Äquivalent) pro 200 l wieder aufsetzen. Übertragen Sie diese Suspension in 3 ml Polypropylenrohre. Um den Färbepuffer zu sterilisieren, filtern Sie ihn mit einem 0,22 m-Filter. Vor der Transplantation die Mäuse durch Sevofluran oder Isofluran-Inhalation anästhesieren. Zur Transplantation von 5000 kultivierten HSCs (Tag 0 Äquivalent) injizieren Sie 200 l der Zellsuspension in die Schwanzvene oder retro-Orbitalsinus von NOG-Mäusen, die in Schritt 7.1 mit einer 1 ml Spritze und einer 27-Spur-Nadel bestrahlt wurden. Frisch isolierte oder aufgetaute Knochenmark-HSCs können als Kontrolle transplantiert werden. Handschuhe sollten zwischen jedem Verfahren mit 70% v/v Ethanol sterilisiert werden. 8. Analyse der Häufigkeit von vom Menschen abgeleiteten Zellen im peripheren Blut Um die Repopulation menschlicher Zellen zu untersuchen, sammeln Sie das periphere Blut bei 1, 2 und 3 Monaten nach der Transplantation. Bevor Sie das periphere Blut sammeln, befeuchten Sie die Mäuse durch Sevofluran-Inhalation. Sammeln Sie 40-80 l peripheres Blut aus der retro-orbitalen Sinus mit heparinisierten Glaskapillarröhren und setzen Sie diese Probe in 1 ml PBS + Heparin (1 U/ml) in 1,5 ml Röhren auf. Zentrifuge die Blutsuspension bei 340 × g für 3 min bei 4 °C. Entsorgen Sie den Überstand und setzen Sie das Pellet in 1 ml PBS + 1,2 % w/v Dextran (200 kDa) 45 min bei Raumtemperatur wieder auf. Übertragen Sie den Überstand in 3 min. auf ein weiteres 1,5 ml Rohr und eine Zentrifuge bei 340 × g. Bei roter Blutzelllyse die Zellen in 0,17 M NH4Cl für 5 min wieder aussetzen. Zentrifugieren Sie die Zellsuspension 340 × g für 3 min bei 4 °C. Setzen Sie die Zellen in 50 l Färbungspuffer mit 0,3 l Anti-Maus-Fc-Block aus. Inkubieren Sie diese Probe bei 4 °C für 5 min. Fügen Sie die folgenden Antikörper für die Oberflächenmarkerfärbung hinzu: 0,3 l Maus CD45-PE-Cy7, 0,3 l Maus Ter-119-PE-Cy7, 0,3 l menschliche CD45-BV421, 0,3 l menschliche CD13-PE, 1,2 l menschliche CD33-PE, 0,3 l menschliche CD19-APC, 0,3 l menschliche CD3-APC-Cy7. Inkubieren Sie die Zellen bei 4 °C für 15 min. Einmal mit 1 ml Färbepuffer und Zentrifuge bei 340 × g 5 min bei 4 °C waschen. Entsorgen Sie den Überstand und setzen Sie die Zellen in 200 l Desstrichpuffer + 0,1 % v/v PI wieder aus. Übertragen Sie die Zellsuspension auf eine 96-Well-Flachbodenplatte und erfassen Sie Daten mit dem Durchflusszytometer im Schnellmodus mit dem Mix-Sample-Modus auf und einem Aufnahmevolumen von 100 l. Exportieren Sie die Daten im FCS-Format zur Analyse mit Software wie FlowJo. Richten Sie das Durchflusszytometer ein. Erfassen Sie Daten für die Proben im schnellen Modus mit dem Mix-Sample-Modus auf und einem Aufnahmevolumen von 100 l. Exportieren Sie die Daten im FCS-Format zur Analyse mit Software wie FlowJo.