Un método de cultivo para mantener las células madre hematopoyéticas humanas quiescentes

El protocolo sigue las directrices del Centro Nacional de Salud y Medicina Mundial. Todos los procedimientos experimentales realizados en ratones son aprobados por el Comité de Experimentos con Animales del Centro Nacional de Salud y Medicina Global.NOTA: Se ilustra una visión general del protocolo en la Figura 1. 1. Preparación lipídica Disolver los siguientes lípidos en metanol en tubos de vidrio a las concentraciones indicadas: palmitato sódico, 16 mg/ml; oleato de sodio, 30 mg/ml; y colesterol, 4 mg/ml. Almacene la solución lipídica a -30 °C y descongele la muestra antes de usarla. Mezcle las soluciones lipídicas preparadas en el paso 1.1 en un tubo de vidrio fresco a las dosis necesarias para obtener la concentración final de 100 μg/ml de palmitato, 100 μg/mL oleato y 20 μg/mL de colesterol. Por ejemplo, al preparar 10 ml de medios de cultivo, mezcle 62,5 μL de solución de palmitato, 33 μL de solución de oleato y 50 μL de solución de colesterol en el tubo de vidrio. Evaporar el metanol pasando gas nitrógeno a través de la solución lipídica(Figura 2A y 2B). Si no hay gas nitrógeno disponible, pase aire a través de la solución mediante una pipeta-ayuda. Evapore completamente el metanol restante calentando el tubo de vidrio en un baño de agua a 37 °C(Figura 2C).NOTA: El uso de una alta concentración de gas N2 en el espacio confinado es potencialmente dañino. Aunque el volumen utilizado en el protocolo para evaporar el metanol es limitado y por lo tanto se considera seguro, ventilar la habitación adecuadamente y etiquetar áreas de concentraciones potencialmente altas de gas N2 es importante en caso de que se produzca una fuga de gas inesperada. 2. Preparación media Prepare el medio Eagle modificado (DMEM) /F12 de Dulbecco (con HEPES y glutamina). Añadir sulfato de penicilina y estreptomicina al medio a la concentración final de 50 unidades y 50 μg/ml, respectivamente. El medio DMEM/F12 que contiene antibióticos se puede almacenar a 4 °C durante al menos 2 meses. Añadir 4% w/v de albúmina sérica bovina (BSA) al medio Eagle modificado (DMEM) / F12 de Dulbecco (con HEPES y glutamina). Ajuste el pH del medio al pH 7.4-7.8 utilizando la solución NaOH, normalmente a pH 7.6. Agregue el medio al tubo de vidrio preparado en el paso 1. Para lograr una solución con máxima solubilidad, se recomienda la adición de medio de 3-15 ml. Disolver completamente los lípidos por sonicación (óptimo: más de 20 min de sonicación). Después de disolver el BSA y los lípidos, la muestra debe almacenarse a -80 °C y utilizarse en un plazo de 2 meses. Descongelar inmediatamente antes de su uso. Agregue 1/1.000 de la mezcla de insulina, transferrina, selenito sódico y amina de etanol (ITS-X) al DMEM/F12. Filtre el medio mixto utilizando un filtro de 0,22 μm (designado como “medio de referencia cultural”). Antes de su uso, agregue el factor de células madre humanas (SCF) y la trombopoietina humana (TPO) a los medios de cultivo a una concentración final de 3 ng/ml cada uno. Después de añadir las citoquinas y ITS-X, el medio no se puede almacenar. Tampone de tinción: Agregue un 10% de FCS a la solución salina tamponada de fosfato sin ca y mg (PBS). Esta solución se puede almacenar a 4 °C durante 2 semanas. Medios de descongelación: Agregue un 10% de FCS al DMEM/F12. Esta solución es de un solo uso. Solución de citoquina: Disolver cada SCF humano o TPO humano en PBS (libre de ca y mg) a 20 μg/ml. Esta solución se puede almacenar a -80 °C durante al menos un año sin pérdida de actividad. Una vez descongelada, guarde la solución de stock a 4 °C y utilíquela en un plazo de 1 mes.NOTA: Examine el lote después de cada compra para evitar variaciones en los contaminantes en BSA. Cultivo HSC al mismo tiempo con diferentes lotes de BSA y examinar el número fenotípico HSC en el día 7 como se describe a continuación. Si un lote de BSA muestra un número bajo o una frecuencia de celdas CD34+ (por ejemplo, menos de la mitad del número de celdas de entrada), evite usar este lote. 3. Preparación de médula ósea humana CD34+ células Comprar cd34 humano+ células de médula ósea y almacenar las células en nitrógeno líquido hasta su uso. Alternativamente, las células de médula ósea de un voluntario saludable o glóbulos de cordón fresco pueden ser utilizadas tras la aprobación del comité ético del instituto y el consentimiento del donante. Caliente 10 ml de medios de descongelación en un tubo cónico de 15 ml en un baño de agua de 37 °C. Descongelar las células congeladas en viales en un baño de agua a 37 °C en 2 minutos. Después de limpiar el vial con 70% de etanol para eliminar contaminantes, transfiera las células al tubo cónico de 15 ml que contiene el medio precalentado del paso 3.2. Centrífuga el tubo de 15 ml a 200 × g durante 15 minutos a temperatura ambiente. Aspirar el sobrenadante cuidadosamente para mantener el pellet intacto (dejando < 50 μL de medio). Resuspend las células con el medio restante y transfiéralas a un tubo de 1,5 ml sobre hielo.NOTA: La exposición a muestras derivadas de personas directamente en la mucosa, incluido el ojo o el tejido herido, puede causar infección por patógenos conocidos o desconocidos; por lo tanto, guantes y anteojos se recomiendan al manipular células humanas. Incluso si las células CD34+ compradas dan negativo para el virus de la hepatitis B (VHB), el virus de la hepatitis C (VHC) y el virus de inmunodeficiencia humana 1 (VIH1), se debe realizar un seguimiento cuidadoso de acuerdo con las directrices institucionales si se produce una incidencia de exposición. Siga las directrices institucionales al deshacerse de materiales expuestos a células humanas. 4. Clasificación de HSC Etiquete las células con anticuerpos fluorocromos conjugados. Mezclar 50 μL de tampone de tinción más 10 μL de anti-CD34-FITC, 2 μL de anti-CD38-PerCP-Cy5.5, 5 μL de anti-CD90-PE-Cy7 y 10 μL de anti-CD45RA-PE. Resuspend el pellet celular en la mezcla de anticuerpos. Incubar las células durante 30 min a 4 °C en la oscuridad. Agregue 1 ml de tampone de tinción para lavar los anticuerpos. Centrífuga los tubos a 340 × g durante 5 min a 4 °C. Deseche el sobrenadante. Resuspend el pellet celular en 0,5 ml de tampone de tinción + 0,1% yoduro de propidio. Transfiera la suspensión a un tubo de 5 ml utilizando un filtro de 40 μm. Enciba los HSC fenotípicos dentro del PI-CD34+CD38-CD90+CD45RA- fracción utilizando el FACS Aria-IIIu y ordene las células en un tubo de 1,5 ml lleno con 500 μL de medios de cultivo (Figura 3). Usando la estrategia de gating mostrada en la Figura 3, ~10% de CD34+ se espera que las células sean HSC fenotípicos. Registre el número de celda ordenado para calcular el volumen de medios para resuspend las celdas en el paso 5.3.NOTA: La estrategia de gating se realiza como se describió anteriormente16 mientras se omite la tinción del marcador de linaje dada la baja expresión de marcadores de linaje en la fracción CD34+CD38- de individuos sanos17 . Centrífuga las celdas ordenadas a 340 × g durante 5 min a 4 °C y deseche el sobrenadante. Aspirar cuidadosamente el sobrenadante para asegurarse de que el pellet permanece intacto. Almacene las celdas ordenadas en hielo hasta la cultura.NOTA: Durante el primer experimento se debe realizar una compensación por fluorescencia de superposición espectral. 5. Cultivo celular Transfiera 200 μL de los medios de cultivo que contienen citoquinas preparadas en el paso 2 en placas planas de 96 pozos. Para evitar la evaporación del medio, llene todos los pozos no utilizados con 100-200 μL de PBS. Resuspend los HSC ordenados en medios de cultivo sin citoquinas a 60 células/μL. Aliquot 600 HSCs/well (10 μL de suspensión celular) en cada pozo. El número de celda se puede modificar. Menos de 300 células conducirán a una variación técnica mayor, y por lo tanto se necesitan más pozos por condición para detectar diferencias biológicas. Se debe evitar la cultivo de más de 1000 células en un solo pozo debido a la privación de citoquinas/nutrientes o la acumulación de citoquinas/quimioquinas desfavorables. Culta las células en una incubadora de múltiples gases humidificada a 37 °C en una atmósfera de 5% CO2 y 1% O2. Para cultivos de más de 7 días, se recomienda reemplazar la mitad del volumen de medios cada 3-4 días. Aspirar cuidadosamente 100 μL de medios pipeteando y añadir 100 μL de medios de cultivo recién preparados que contengan citoquinas a cada pozo. Los medios de cultivo deben ser pre-calentados a 37 °C. 6. Análisis de fenotipos de marcadores utilizando citometría de flujo NOTA: Aunque las células deben analizarse después de 7 días de cultivo, la duración de la referencia cultural se puede cambiar. Deseche 170 μL del medio mediante una pipeta de 8 canales. Etiquete las células con la mezcla de anticuerpos. Mezclar 0,5 μL de anti-CD34-FITC, 0,1 μL de anti-CD38-PerCP-Cy5,5, 0,25 μL de anti-CD90-PE-Cy7, 0,5 μL de anti-CD45RA-PE y 9 μL de tambalo por pozo. Añadir 10 μL de la mezcla a la placa de 96 pozos e incubar las células durante 30 min a 4 °C en la oscuridad. Para lavar los anticuerpos, añadir 100 μL de amortiguador de tinción a los pozos y centrifugar las placas a 400 × g durante 5 minutos a 4 °C utilizando baja aceleración y desaceleración media. Aspirar cuidadosamente 100 μL del sobrenadante para mantener las células en la parte inferior de los pozos, luego resuspend las células en 200 μL de tampone de tinción + 0.1% v/v de PI + 1% v/v de microesferas fluorescentes (por ejemplo, Fluorosferas de control de flujo). Configure el instrumento de citometría de flujo. Adquiera datos para las muestras en modo rápido con el modo de muestra mixta activado y volúmenes de captación de 100 μL. Exporte los datos en formato FCS y analícelos utilizando software como FlowJo. Los números de celda se pueden determinar utilizando el recuento de cuentas de microesfera fluorescente. Por ejemplo, si el investigador agrega 2000 cuentas por pozo y el recuento de cuentas es de 700, multiplique el número de células de cada fracción para 2000/700 para estimar el número total de células de la fracción en el pozo.NOTA: Las microesferas fluorescentes son tóxicas para las células cultivadas debido a la presencia de formaldehído. Esto puede inducir la muerte celular durante el análisis. Minimice el número de pozos (<50 pozos) analizados continuamente para evitar sesgos. 7. Trasplante de HSCs humanos NOTA: La actividad de repoblación de las células cultivadas se valida mediante trasplante a ratones inmunodeficientes. Todos los procedimientos deben ser aprobados por comités de experimentos con animales o sus equivalentes. Como donantes, prepare un número suficiente de ratones inmunodeficientes NOD-SCID-Il2rg-null (NOG) de 8-12 semanas. Como los ratones NOG son altamente susceptibles a la infección, mantenga las jaulas de cría lo más limpias posible y alimente a los ratones con una dieta esterilizada y agua. Cultivo un número adecuado de HSC para trasplante como se describe en el paso 5. Por ejemplo, cuando 5000 HSC (día 0 equivalente) son trasplantados a 6 ratones receptores, cultivo 35,000-40,000 HSC en 40 pozos de una placa de 96 pozos (200 μL de medios de cultivo por pozo) o en 8 pozos de una placa de 24 pozos (1 mL de medios de cultivo por pozo). Culta las células durante 2 semanas con cambios de medio medio soporte cada 3-4 días en una incubadora multigás humidificada a 37 °C con 5% de CO2 y 1% O2. La duración de la referencia cultural se puede modificar. Irradia ratones NOG a 2,5 Gy a 6-24 h antes del trasplante. Recoja los HSC cultivados en tubos de 1,5 ml. Centrífuga los tubos a 340 ×g durante 5 min a 4°C. Aspirar cuidadosamente los sobrenautas y volver a usar las células en tampones estériles de tinción helada a una densidad celular de 5000 HSC (día 0 equivalente) por 200 μL. Para esterilizar el búfer de tinción, filtrelo utilizando un filtro de 0,22 μm. Antes del trasplante, anestesia a los ratones por inhalación de sevoflurano o isoflurano. Para trasplantar 5000 HSC cultivados (día 0 equivalente), inyecte 200 μL de la suspensión celular en la vena de la cola o el seno orbital retro de ratones NOG irradiados en el paso 7.1 utilizando una jeringa de 1 ml y una aguja de calibre 27. Los HSC de médula ósea recién aislados o descongelados se pueden trasplantar como control. Los guantes deben esterilizarse con un 70% de etanol v/v entre cada procedimiento. 8. Análisis de la frecuencia de las células derivadas de las personas en la sangre periférica Para examinar la repoblación de células humanas, recoger la sangre periférica a 1, 2 y 3 meses después del trasplante. Antes de recoger la sangre periférica, anestesia a los ratones por inhalación de sevoflurano. Recoger 40-80 μL de sangre periférica del seno retro-orbital utilizando tubos capilares de vidrio heparinizado y suspender esta muestra en 1 ml de PBS + heparina (1 U/ml) en tubos de 1,5 ml. Centrífuga la suspensión sanguínea a 340 × g durante 3 min a 4 °C. Deseche el sobrenadante y vuelva a gastar el pellet en 1 ml de PBS + 1,2% w/v dextran (200 kDa) durante 45 min a temperatura ambiente. Transfiera el sobrenadante a otro tubo y centrífuga de 1,5 ml a 340 × g durante 3 minutos. Para la lisis de los glóbulos rojos, resuspend las células en 0,17 M NH4Cl durante 5 min. Centrífuga la suspensión celular 340 × g durante 3 min a 4 °C. Resuspend las células en 50 μL de tampone de tinción que contiene 0,3 μL de bloque Fc anti-ratón. Incubar esta muestra a 4 °C durante 5 min. Añadir los siguientes anticuerpos para la tinción del marcador de superficie: 0,3 μL de ratón CD45-PE-Cy7, 0,3 μL ratón Ter-119-PE-Cy7, 0,3 μL de CD45-BV421 humano, 0,3 μL de CD13-PE humano, 1,2 μL de CD33-PE humano, 0,3 μL de CD19-APC humano, 0,3 μL de CD3-APC-Cy7 humano. Incubar las células a 4 °C durante 15 min. Lave una vez con 1 ml de amortiguador de tinción y centrífuga a 340 × g durante 5 minutos a 4 °C. Deseche el sobrenadante y vuelva a abrir las células en 200 μL de tampone de tinción + 0,1% v/v de PI. Transfiera la suspensión celular a una placa de fondo plano de 96 pozos y adquiera datos utilizando el cytómetro de flujo en modo rápido con el modo de muestra de mezcla activado y un volumen de absorción de 100 μL. Exporte los datos en formato FCS para su análisis utilizando software como FlowJo. Configure el cytómetro de flujo. Adquiera datos para las muestras en modo rápido con el modo de muestra de mezcla activado y un volumen de absorción de 100 μL. Exporte los datos en formato FCS para su análisis utilizando software como FlowJo.