Een kweekmethode om rustgevende menselijke hematopoëtische stamcellen te behouden

Het protocol volgt de richtlijnen van het National Center for Global Health and Medicine. Alle experimentele procedures die op muizen worden uitgevoerd, zijn goedgekeurd door de animal experiment committee van het National Center for Global Health and Medicine.OPMERKING: Een overzicht van het protocol is weergegeven in figuur 1. 1. Lipidenpreparaat Los de volgende lipiden op in methanol in glazen buizen in de aangegeven concentraties: natriumpalmitaat, 16 mg/ml; natriumoleaat, 30 mg/ml; en cholesterol, 4 mg/ml. Bewaar de lipidenoplossing bij -30 °C en ontdooi het monster voor gebruik. Meng de lipideoplossingen bereid in stap 1.1 in een verse glazen buis in de doses die nodig zijn om de uiteindelijke concentratie van 100 μg/ml palmitaat, 100 μg/ml oleaat en 20 μg/ml cholesterol te verkrijgen. Meng bijvoorbeeld bij het bereiden van 10 ml kweekmedia 62,5 μL palmitaatoplossing, 33 μL oleaatoplossing en 50 μL cholesteroloplossing in de glazen buis. Verdamper het methanol door stikstofgas door de lipideoplossing te leiden (figuur 2A en 2B). Als er geen stikstofgas beschikbaar is, laat dan lucht door de oplossing met behulp van een pipethulpmiddel. Verdampt de resterende methanol volledig door de glazen buis in een waterbad op 37 °C te verwarmen (figuur 2C).OPMERKING: Het gebruik van een hoge concentratie N2-gas in besloten ruimte is potentieel schadelijk. Hoewel het volume dat in het protocol wordt gebruikt om methanol te verdampen beperkt is en dus als veilig wordt beschouwd, is het belangrijk om de ruimte adequaat te ventileren en gebieden met potentieel hoge concentraties N2-gas te labelen als er een onverwacht gaslek optreedt. 2. Medium voorbereiding Bereid Dulbecco’s gemodificeerde Eagle medium (DMEM)/F12 medium (met HEPES en glutamine). Voeg penicilline en streptomycinesulfaat toe aan het medium tot de uiteindelijke concentratie van respectievelijk 50 eenheden en 50 μg/ml. DMEM/F12 medium bevattende antibiotica kunnen ten minste 2 maanden bij 4 °C worden bewaard. Voeg 4% w/v runderserumalbumine (BSA) toe aan Dulbecco’s gemodificeerde Eagle medium (DMEM)/F12 medium (met HEPES en glutamine). Stel de pH van het medium in op pH 7,4-7,8 met behulp van de NaOH-oplossing, meestal op pH 7,6. Voeg het medium toe aan de glazen buis die in stap 1 is voorbereid. Om een oplossing met maximale oplosbaarheid te bereiken, wordt toevoeging van 3-15 ml medium aanbevolen. Los de lipiden volledig op door sonicatie (optimaal: meer dan 20 minuten sonicatie). Nadat de BSA en lipiden zijn opgelost, moet het monster bij -80 °C worden bewaard en binnen 2 maanden worden gebruikt. Ontdooi onmiddellijk voor gebruik. Voeg 1/1.000 van het mengsel insuline, transferrine, natriumseleniet en ethanolamine (ITS-X) toe aan het DMEM/F12. Filter het gemengde medium met een filter van 0,22 μm (aangeduid als “kweekmedia”). Voeg voor gebruik de humane stamcelfactor (SCF) en humane trombopoëtine (TPO) toe aan de kweekmedia bij een eindconcentratie van 3 ng/ml per stuk. Na toevoeging van de cytokinen en ITS-X kan het medium niet meer worden opgeslagen. Kleuringsbuffer: Voeg 10% FCS toe aan Ca- en Mg-vrije fosfaatgebufferde zoutoplossing (PBS). Deze oplossing kan gedurende 2 weken bij 4 °C worden bewaard. Ontdooimedia: Voeg 10% FCS toe aan de DMEM/F12. Deze oplossing is voor eenmalig gebruik. Cytokine stamoplossing: Los elke menselijke SCF of humane TPO op in PBS (Ca- en Mg-vrij) bij 20 μg/ml. Deze oplossing kan ten minste één jaar bij -80 °C worden bewaard zonder verlies van activiteit. Eenmaal ontdooid, bewaar de voorraadoplossing op 4 °C en gebruik binnen 1 maand.OPMERKING: Onderzoek de partij na elke aankoop om variatie in de verontreinigingen in BSA te voorkomen. Kweek HSC’s tegelijkertijd met verschillende partijen BSA en onderzoek het fenotypische HSC-nummer op dag 7 zoals hieronder beschreven. Als een BSA-batch een laag aantal of frequentie cd34+-cellen weergeeft (bijvoorbeeld minder dan de helft van het aantal invoercellen), vermijd dan het gebruik van deze batch. 3. Bereiding van menselijk beenmerg CD34+ cellen Koop menselijke CD34+ beenmergcellen en bewaar de cellen in vloeibare stikstof tot gebruik. Als alternatief kunnen beenmergcellen van een gezonde vrijwilliger of verse navelstrengbloedcellen worden gebruikt na goedkeuring door de ethische commissie van het instituut en toestemming van de donor. Verwarm 10 ml ontdooimedia in een conische buis van 15 ml in een waterbad van 37 °C. Ontdooi de bevroren cellen in flacons in een waterbad van 37 °C binnen 2 minuten. Nadat u de flacon met 70% ethanol hebt afgeveegd om verontreinigingen te verwijderen, brengt u de cellen vanaf stap 3.2 over naar de conische buis van 15 ml met het voorverwarmde medium. Centrifugeer de buis van 15 ml op 200 × g gedurende 15 minuten bij kamertemperatuur. Aspireer het supernatant voorzichtig om de pellet intact te houden (laat < 50 μL medium achter). Resuspendeer de cellen met het resterende medium en breng ze over in een buis van 1,5 ml op ijs.OPMERKING: Blootstelling aan monsters van menselijke afbakening rechtstreeks in het slijmvlies, met inbegrip van het oog of gewond weefsel, kan infectie veroorzaken door bekende of onbekende ziekteverwekkers; handschoenen en brillen worden daarom aanbevolen bij het hanteren van menselijke cellen. Zelfs als de gekochte CD34+ cellen negatief testen op hepatitis B-virus (HBV), hepatitis C-virus (HCV) en humaan immunodeficiëntievirus 1 (HIV1), moet zorgvuldige monitoring worden uitgevoerd volgens institutionele richtlijnen als er een blootstellingsincidentie optreedt. Volg de institutionele richtlijnen bij het weggooien van materialen die zijn blootgesteld aan menselijke cellen. 4. Sorteren van HSC’s Label de cellen met fluorchrome geconjugeerde antilichamen. Meng 50 μL kleurbuffer plus 10 μL anti-CD34-FITC, 2 μL anti-CD38-PerCP-Cy5.5, 5 μL anti-CD90-PE-Cy7 en 10 μL anti-CD45RA-PE. Resuspend de celkorrel in het antilichaammengsel. Incubeer de cellen gedurende 30 minuten bij 4 °C in het donker. Voeg 1 ml kleurbuffer toe om de antilichamen te wassen. Centrifugeer de buizen bij 340 × g gedurende 5 min bij 4 °C. Gooi het supernatant weg. Resuspendeer de celkorrel in 0,5 ml kleurbuffer + 0,1% propidiumjodide. Breng de suspensie over in een buis van 5 ml met behulp van een filter van 40 μm. Poort de fenotypische HSC’s binnen de PI-CD34+CD38-CD90+CD45RA- fractie met behulp van de FACS Aria-IIIu en sorteer de cellen in een buis van 1,5 ml gevuld met 500 μL kweekmedia (figuur 3). Met behulp van de gatingstrategie in figuur 3wordt verwacht dat ~10% van de CD34+ cellen fenotypische HSC’s zijn. Noteer het gesorteerde celnummer om het volume van de media te berekenen om de cellen in stap 5.3 te resuspenden.OPMERKING: De gatingstrategie wordt uitgevoerd zoals eerder beschreven16, terwijl de afstammingsmarkerkleuring wordt weggelaten gezien de lage expressie van afstammingsmarkers in de CD34+CD38-fractie van gezonde individuen17 . Centrifugeer de gesorteerde cellen op 340 × g gedurende 5 min bij 4 °C en gooi het supernatant weg. Aspireer het supernatant voorzichtig om ervoor te zorgen dat de pellet intact blijft. Bewaar de gesorteerde cellen op ijs tot kweek.OPMERKING: Fluorescentiecompensatie van spectrale overlapping moet tijdens het eerste experiment worden uitgevoerd. 5. Celcultuur Breng 200 μL van de kweekmedia die cytokinen bevatten, bereid in stap 2, over in platbodemplaten van 96 putjes. Om verdamping van het medium te voorkomen, vult u alle ongebruikte putten met 100-200 μL PBS. Resuspend de gesorteerde HSC’s in kweekmedia zonder cytokinen bij 60 cellen/μL. Aliquot 600 HSC’s/put (10 μL celsuspensie) in elke put. Het celnummer kan worden gewijzigd. Minder dan 300 cellen zullen leiden tot grotere technische variatie, en dus zijn er meer putten per aandoening nodig om biologische verschillen op te sporen. Het cultiveren van meer dan 1000 cellen in één put moet worden vermeden vanwege cytokine/nutriëntentekort of accumulatie van ongunstige cytokinen/chemokinen. Kweek de cellen in een bevochtigde multi-gas incubator bij 37 °C in een 5% CO2 en 1% O2 atmosfeer. Voor culturen van meer dan 7 dagen wordt aanbevolen om elke 3-4 dagen de helft van het mediavolume te vervangen. Aspireer voorzichtig 100 μL media door pipetten en voeg 100 μL nieuw bereide kweekmedia met cytokinen toe aan elke put. De cultuurmedia moeten worden voorverwarmd bij 37 °C. 6. Analyse van markerfenotypes met behulp van flowcytometrie OPMERKING: Hoewel de cellen na 7 dagen cultuur moeten worden geanalyseerd, kan de kweekduur worden gewijzigd. Gooi 170 μL van het medium weg met behulp van een 8-kanaals pipet. Label de cellen met het antilichaammengsel. Meng 0,5 μL anti-CD34-FITC, 0,1 μL anti-CD38-PerCP-Cy5.5, 0,25 μL anti-CD90-PE-Cy7, 0,5 μL anti-CD45RA-PE en 9 μL kleurbuffer per put. Voeg 10 μL van het mengsel toe aan de 96-putplaat en incubeer de cellen gedurende 30 minuten bij 4 °C in het donker. Om de antilichamen te wassen, voegt u 100 μL kleuringsbuffer toe aan de putten en centrifugeert u de platen op 400 × g gedurende 5 minuten bij 4 °C met behulp van lage acceleratie en gemiddelde vertraging. Aspireer voorzichtig 100 μL van het supernatant om de cellen op de bodem van de putten te houden en resuspeneer de cellen vervolgens in 200 μL kleurbuffer + 0,1% v/v PI + 1% v/v fluorescerende microsferen (bijv. Flow-Check Fluorospheres). Stel het flow cytometrie instrument in. Verkrijg gegevens voor de monsters in de snelle modus met gemengde monstermodus en opnamevolumes van 100 μL. Exporteer de gegevens in FCS-indeling en analyseer deze met behulp van software zoals FlowJo. Celnummers kunnen worden bepaald met behulp van het aantal fluorescerende microsfeerparellen. Als de onderzoeker bijvoorbeeld 2000 kralen per put toevoegt en het aantal kraaltjes 700 is, vermenigvuldigt hij het celnummer van elke breuk met 2000/700 om het totale celnummer van de breuk in de put te schatten.OPMERKING: Fluorescerende microbolletjes zijn giftig voor gekweekte cellen vanwege de aanwezigheid van formaldehyde. Dit kan celdood veroorzaken tijdens de analyse. Minimaliseer het aantal putten (<50 putten) dat continu wordt geanalyseerd om bias te voorkomen. 7. Transplantatie van menselijke HSC’s OPMERKING: Herbevolkingsactiviteit van gekweekte cellen wordt gevalideerd door transplantatie naar immunodeficiënte muizen. Alle procedures moeten worden goedgekeurd door comités voor dierproeven of hun equivalenten. Bereid als donor een voldoende aantal immunodeficiënte NOD-SCID-Il2rg-null (NOG) muizen van 8-12 weken voor. Omdat NOG-muizen zeer vatbaar zijn voor infectie, houd de kweekkooien zo schoon mogelijk en voed de muizen met een gesteriliseerd dieet en water. Kweek een voldoende aantal HSC’s voor transplantatie zoals beschreven in stap 5. Bijvoorbeeld, wanneer 5000 HSC’s (dag 0 equivalent) worden getransplanteerd naar muizen met 6 ontvangers, kweek dan 35.000-40.000 HSC’s in 40 putten van een 96-putplaat (200 μL kweekmedia per put) of in 8 putten van een 24-putplaat (1 ml kweekmedia per put). Kweek de cellen gedurende 2 weken met halfmediale veranderingen om de 3-4 dagen in een bevochtigde multi-gas incubator bij 37 °C met 5% CO2 en 1% O2. De cultuurduur kan worden gewijzigd. Bestraal NOG muizen bij 2,5 Gy om 6-24 uur voorafgaand aan de transplantatie. Verzamel de gekweekte HSC’s in buizen van 1,5 ml. Centrifugeer de buizen op 340 ×g gedurende 5 min bij 4°C. Aspireer de supernatanten zorgvuldig en resuspendeer de cellen in steriele ijskoude kleuringsbuffer bij een celdichtheid van 5000 HSC’s (dag 0 equivalent) per 200 μL. Breng deze suspensie over op 3 ml polypropyleen buizen. Om de kleuringsbuffer te steriliseren, filtert u deze met een filter van 0,22 μm. Verdoof de muizen vóór de transplantatie door inademing van sevofluraan of isofluraan. Om 5000 gekweekte HSC’s (dag 0-equivalent) te transplanteren, injecteert u 200 μL van de celsuspensie in de staartader of retro orbitale sinus van NOG-muizen die in stap 7.1 zijn bestraald met behulp van een spuit van 1 ml en een naald met een 27 gauge. Vers geïsoleerde of ontdooide beenmerg HSC’s kunnen als controle worden getransplanteerd. Handschoenen moeten tussen elke procedure worden gesteriliseerd met 70% v/v ethanol. 8. Analyse van de frequentie van door de mens afgeleide cellen in het perifere bloed Om de herbevolking van menselijke cellen te onderzoeken, verzamelt u het perifere bloed op 1, 2 en 3 maanden na transplantatie. Voordat u het perifere bloed verzamelt, verdooft u de muizen door sevofluraaninhalatie. Verzamel 40-80 μL perifeer bloed uit de retro-orbitale sinus met behulp van gepariniseerde glazen capillaire buizen en hang dit monster op in 1 ml PBS + heparine (1 U/ml) in 1,5 ml buizen. Centrifugeer de bloedsuspensie bij 340 × g gedurende 3 min bij 4 °C. Gooi het supernatant weg en resuspend de pellet in 1 ml PBS + 1,2% w/v dextran (200 kDa) gedurende 45 minuten bij kamertemperatuur. Breng het supernatant over naar een andere buis van 1,5 ml en centrifugeer gedurende 3 minuten op 340 × g. Voor rode bloedcellysis, resuspend de cellen in 0.17 M NH4Cl gedurende 5 min. Centrifugeer de celsuspensie 340 × g gedurende 3 min bij 4 °C. Resuspendeer de cellen in 50 μL kleurbuffer met 0,3 μL antimuis Fc-blok. Incubeer dit monster gedurende 5 minuten bij 4 °C. Voeg de volgende antilichamen toe voor oppervlaktemarkerkleuring: 0,3 μL muis CD45-PE-Cy7, 0,3 μL muis Ter-119-PE-Cy7, 0,3 μL menselijk CD45-BV421, 0,3 μL menselijk CD13-PE, 1,2 μL humaan CD33-PE, 0,3 μL Incubeer de cellen gedurende 15 minuten bij 4 °C. Was eenmaal met 1 ml kleurbuffer en centrifugeer op 340 × g gedurende 5 minuten bij 4 °C. Gooi het supernatant weg en resuspend de cellen in 200 μL kleurbuffer + 0,1% v/v PI. Breng de celsuspensie over naar een 96-put vlakke bodemplaat en verkrijg gegevens met behulp van de flowcytometer in de snelle modus met de mixmonstermodus aan en een opnamevolume van 100 μL. Exporteer de gegevens in FCS-indeling voor analyse met behulp van software zoals FlowJo. Stel de flow cytometer in. Verkrijg gegevens voor de monsters in de snelle modus met de mixmonstermodus aan en een opnamevolume van 100 μL. Exporteer de gegevens in FCS-indeling voor analyse met behulp van software zoals FlowJo.