Un metodo di coltura per mantenere le cellule staminali ematopoietiche umane quiescenti

Il protocollo segue le linee guida del National Center for Global Health and Medicine. Tutte le procedure sperimentali eseguite sui topi sono approvate dal Comitato nazionale per la salute e la medicina degli animali.NOTA: Una panoramica del protocollo è illustrata nella figura 1. 1. Preparazione lipidica Sciogliere i seguenti lipidi in metanolo in tubi di vetro alle concentrazioni indicate: palmitato di sodio, 16 mg/ml; oleato di sodio, 30 mg/mL; e colesterolo, 4 mg/mL. Conservare la soluzione lipidica a -30 °C e scongelare il campione prima dell’uso. Mescolare le soluzioni lipidiche preparate nella fase 1.1 in un tubo di vetro fresco alle dosi necessarie per ottenere la concentrazione finale di palmitato 100 μg/mL, oleato 100 μg/ml e colesterolo 20 μg/ml. Ad esempio, quando si preparano 10 ml di mezzi di coltura, mescolare 62,5 μL di soluzione di palmitato, 33 μL di soluzione di oleato e 50 μL di soluzione di colesterolo nel tubo di vetro. Evaporare il metanolo passando il gas azoto attraverso la soluzione lipidica(figura 2A e 2B). Se il gas azoto non è disponibile, passare l’aria attraverso la soluzione utilizzando un ausilio per pipette. Evaporare completamente il metanolo rimanente riscaldando il tubo di vetro in un bagno d’acqua a 37 °C(Figura 2C).NOTA: L’uso di un’alta concentrazione di gas N2 nello spazio confinato è potenzialmente dannoso. Sebbene il volume utilizzato nel protocollo per evaporare il metanolo sia limitato e quindi sia considerato sicuro, la ventilazione adeguata della stanza e l’etichettatura di aree con concentrazioni potenzialmente elevate di gas N2 è importante in caso di perdita di gas imprevista. 2. Preparazione media Preparare il mezzo Aquila modificato di Dulbecco (DMEM)/F12 medium (con HEPES e glutammina). Aggiungere la penicillina e la streptomicina solfato al mezzo fino alla concentrazione finale di 50 unità e 50 μg/mL, rispettivamente. Il mezzo DMEM/F12 contenente antibiotici può essere conservato a 4 °C per almeno 2 mesi. Aggiungere il 4% w/v di albumina di siero bovino (BSA) al mezzo eagle modificato di Dulbecco (DMEM)/F12 medium (con HEPES e glutammina). Regolare il pH del mezzo in pH 7.4-7.8 utilizzando la soluzione NaOH, in genere a pH 7.6. Aggiungere il mezzo al tubo di vetro preparato al passaggio 1. Per ottenere una soluzione con la massima solubilità, si consiglia l’aggiunta di 3-15 mL di mezzo. Sciogliere completamente i lipidi per sonicazione (ottimale: più di 20 minuti di sonicazione). Dopo lo scioglimento della BSA e dei lipidi, il campione deve essere conservato a -80 °C e utilizzato entro 2 mesi. Scongelare immediatamente prima dell’uso. Aggiungere 1/1.000 della miscela insulina, transferrina, selenite di sodio e etano ammina (ITS-X) al DMEM/F12. Filtrare il mezzo misto utilizzando un filtro da 0,22 μm (designato come “supporto di coltura”). Prima dell’uso, aggiungere il fattore delle cellule staminali umane (SCF) e la trombopoietina umana (TPO) ai mezzi di coltura ad una concentrazione finale di 3 ng/mL ciascuno. Dopo aver aggiunto le citochine e l’ITS-X, il mezzo non può essere conservato. Tampone di colorazione: Aggiungere il 10% di FCS alla salina tamponata con fosfato (PBS) priva di Ca e Mg. Questa soluzione può essere conservata a 4 °C per 2 settimane. Supporto di scongelamento: aggiungere il 10% di FCS al DMEM/F12. Questa soluzione è monoa uso. Soluzione di calcio di citochina: Sciogliere ogni SCF umano o TPO umano in PBS (Ca- e Mg-free) a 20 μg/mL. Questa soluzione può essere conservata a -80 °C per almeno un anno senza perdita di attività. Una volta scongelato, conservare la soluzione stock a 4 °C e utilizzare entro 1 mese.NOTA: Esaminare il lotto dopo ogni acquisto per evitare variazioni nei contaminanti in BSA. Coltura HSC allo stesso tempo con diversi lotti di BSA ed esaminare il numero HSC fenotipico al giorno 7 come descritto di seguito. Se un batch BSA mostra un numero o una frequenza bassi di celle CD34+ (ad esempio meno della metà del numero di celle di input), evitare di utilizzare questo batch. 3. Preparazione del midollo osseo umano CD34+ cellule Acquistare cellule umane CD34+ midollo osseo e conservare le cellule in azoto liquido fino all’uso. In alternativa, le cellule del midollo osseo di un volontario sano o cellule del sangue del cordone ombelicale fresco possono essere utilizzate previa approvazione da parte del comitato etico dell’istituto e del consenso del donatore. Riscaldare 10 ml di mezzi di scongelamento in un tubo conico da 15 ml in un bagno d’acqua a 37 °C. Scongelare le cellule congelate in fiale in un bagno d’acqua a 37 °C entro 2 minuti. Dopo aver pulito la fiala con il 70% di etanolo per rimuovere i contaminanti, trasferire le cellule nel tubo conico da 15 ml contenente il mezzo prerifampto dal passo 3.2. Centrifugare il tubo da 15 ml a 200 × g per 15 minuti a temperatura ambiente. Aspirare attentamente il supernatante per mantenere intatto il pellet (lasciando < 50 μL di mezzo). Rimorsi le cellule con il mezzo rimanente e trasferirle in un tubo da 1,5 ml sul ghiaccio.NOTA: L’esposizione a campioni di origine umana direttamente nella mucosa, compreso l’occhio o il tessuto ferito, può causare infezioni da agenti patogeni noti o sconosciuti; pertanto, guanti e occhiali sono raccomandati quando si maneggiano cellule umane. Anche se le cellule CD34+ acquistate sono negative per il virus dell’epatite B (HBV), il virus dell’epatite C (HCV) e il virus dell’immunodeficienza umana 1 (HIV1), è necessario eseguire un attento monitoraggio secondo le linee guida istituzionali in caso di incidenza dell’esposizione. Seguire le linee guida istituzionali quando si smaltino i materiali esposti alle cellule umane. 4. Smistamento degli HSC Etichettare le cellule con anticorpi coniugati con fluorocromo. Mescolare 50 μL di tampone di colorazione più 10 μL di anti-CD34-FITC, 2 μL di anti-CD38-PerCP-Cy5.5, 5 μL di anti-CD90-PE-Cy7 e 10 μL di anti-CD45RA-PE. Rimosogliere il pellet cellulare nella miscela di anticorpi. Incubare le cellule per 30 minuti a 4 °C al buio. Aggiungere 1 mL di tampone di colorazione per lavare gli anticorpi. Centrifugare i tubi a 340 × g per 5 min a 4 °C. Scartare il supernatante. Rimosoppo il pellet cellulare in 0,5 mL di tampone di colorazione + 0,1% di ioduro di propidio. Trasferire la sospensione in un tubo da 5 ml utilizzando un filtro da 40 μm. Gate gli HSC fenotipico all’interno della frazione PI-CD34+CD38-CD90+CD45RA- utilizzando il FACS Aria-IIIu e ordinare le celle in un tubo da 1,5 ml riempito con 500 μL di mezzi dicoltura (Figura 3). Utilizzando la strategia di gating illustrata nella figura 3, ~10% delle celle CD34+ dovrebbe essere HSC fenotipico. Registrare il numero di cella ordinato per calcolare il volume del supporto per rimpiosi le celle nel passaggio 5.3.NOTA: La strategia di gating viene eseguita come descritto inprecedenza 16 mentre si omette la colorazione del marcatore di lignaggio data la bassa espressione dei marcatori di lignaggio nella frazione CD34+CD38- da individui sani17 . Centrifugare le cellule ordinate a 340 × g per 5 min a 4 °C e scartare il supernatante. Aspirare con cura il supernatante per garantire che il pellet rimanga intatto. Conservare le celle ordinate sul ghiaccio fino alla coltura.NOTA: La compensazione della fluorescenza della sovrapposizione spettrale deve essere eseguita durante il primo esperimento. 5. Coltura cellulare Trasferire 200 μL del supporto di coltura contenente citochine preparate nel passaggio 2 in piastre flat-bottom da 96 pozzi. Per evitare l’evaporazione del mezzo, riempire tutti i pozzi inutilizzati con 100-200 μL di PBS. Rimescolare gli HSC ordinati nei mezzi di coltura senza citochine a 60 cellule/μL. Aliquota 600 HSC/pozzo (10 μL di sospensione cellulare) in ogni pozzo. Il numero di cella può essere modificato. Meno di 300 cellule porteranno a maggiori variazioni tecniche, e quindi sono necessari più pozzi per condizione per rilevare le differenze biologiche. Coltivare più di 1000 cellule in un singolo pozzo dovrebbe essere evitato a causa della privazione di citochine / nutrienti o dell’accumulo di citochine / chemiochine sfavorevoli. Coltura delle cellule in un incubatore multi-gas umidificato a 37 °C in un’atmosfera del 5% di CO2 e dell’1% O2. Per le colture di età superiore a 7 giorni, si consiglia di sostituire metà del volume multimediale ogni 3-4 giorni. Aspirare con cura 100 μL di supporti pipettando e aggiungere 100 μL di mezzi di coltura appena preparati contenenti citochine ad ogni pozzo. I mezzi di coltura devono essere prerifapidi a 37 °C. 6. Analisi dei fenotipi marcatori mediante citometria del flusso NOTA: Sebbene le cellule debbano essere analizzate dopo 7 giorni di coltura, la durata delle impostazioni cultura può essere modificata. Scartare 170 μL del mezzo utilizzando una pipetta a 8 canali. Etichettare le cellule con la miscela di anticorpi. Mescolare 0,5 μL di anti-CD34-FITC, 0,1 μL di anti-CD38-PerCP-Cy5.5, 0,25 μL di anti-CD90-PE-Cy7, 0,5 μL di anti-CD45RA-PE e 9 μL di tampone di colorazione per bene. Aggiungere 10 μL della miscela alla piastra da 96 pozzetti e incubare le cellule per 30 minuti a 4 °C al buio. Per lavare gli anticorpi, aggiungere 100 μL di tampone di colorazione ai pozzi e centrifugare le piastre a 400 × g per 5 min a 4 °C utilizzando bassa accelerazione e decelerazione media. Aspirare con cura 100 μL del supernatante per mantenere le cellule sul fondo dei pozzi, quindi rimescolare le cellule in 200 μL di tampone di colorazione + 0,1% v/v di PI + 1% v/v di microsfere fluorescenti (ad esempio, fluorosfere Flow-Check). Impostare lo strumento di citometria a flusso. Acquisire dati per i campioni in modalità rapida con modalità campione misto su e volumi di assorbimento di 100 μL. Esportare i dati in formato FCS e analizzarli utilizzando software come FlowJo. I numeri cellulari possono essere determinati usando il conteggio delle perline fluorescenti della microsfera. Ad esempio, se il ricercatore aggiunge 2000 perline per pozzo e il conteggio delle perline è 700, moltiplicare il numero di cellule di ogni frazione per 2000/700 per stimare il numero totale di cellule della frazione nel pozzo.NOTA: Le microsfere fluorescenti sono tossiche per le cellule coltivate a causa della presenza di formaldeide. Ciò può indurre la morte cellulare durante l’analisi. Ridurre al minimo il numero di pozzi (<50 pozzi) analizzati continuamente per evitare distorsioni. 7. Trapianto di HSC umani NOTA: L’attività di ripopolamento delle cellule coltivate viene convalidata mediante trapianto a topi immunodifesa. Tutte le procedure devono essere approvate dai comitati per gli esperimenti sugli animali o dai loro equivalenti. Come donatori, preparare un numero sufficiente di topi IMMUNODEFICIENT NOD-SCID-Il2rg-null (NOG) a 8-12 settimane. Poiché i topi NOG sono altamente suscettibili alle infezioni, mantenere le gabbie di allevamento il più pulite possibile e nutrire i topi con una dieta sterilizzata e acqua. Coltura un numero adeguato di HSC per il trapianto come descritto nella fase 5. Ad esempio, quando 5000 HSC (equivalente giorno 0) vengono trapiantati su 6 topi riceventi, coltura 35.000-40.000 HSC in 40 pozzi di una piastra da 96 po ‘(200 μL di mezzi di coltura per pozzo) o in 8 pozzi di una piastra da 24 pozzi (1 mL di mezzi di coltura per pozzo). Coltura delle cellule per 2 settimane con variazioni semi-mediali ogni 3-4 giorni in un incubatore multi-gas umidificato a 37 °C con 5% CO2 e 1% O2. La durata delle impostazioni cultura può essere modificata. Irradiare topi NOG a 2,5 Gy a 6-24 ore prima del trapianto. Raccogliere gli HSC coltivati in tubi da 1,5 ml. Centrifugare i tubi a 340 ×g per 5 min a 4°C. Aspirare con cura i supernaganti e rimorsi le cellule in tampone sterile di colorazione ghiacciata a una densità cellulare di 5000 HSC (equivalente giorno 0) per 200 μL. Trasferire questa sospensione a tubi in polipropilene da 3 ml. Per sterilizzare il tampone di colorazione, filtrarlo utilizzando un filtro da 0,22 μm. Prima del trapianto, anestetizza i topi per inalazione di sevoflurane o isoflurane. Per trapiantare 5000 HSC coltivati (equivalente giorno 0), iniettare 200 μL della sospensione cellulare nella vena della coda o nel seno orbitale retrò dei topi NOG irradiati nella fase 7.1 utilizzando una siringa da 1 ml e un ago calibro 27. Gli HSC del midollo osseo appena isolati o scongelati possono essere trapiantati come controllo. I guanti devono essere sterilizzati con 70% v/v etanolo tra ogni procedura. 8. Analisi della frequenza delle cellule di origine umana nel sangue periferico Per esaminare il ripopolamento delle cellule umane, raccogliere il sangue periferico a 1, 2 e 3 mesi dopo il trapianto. Prima di raccogliere il sangue periferico, anestetizzare i topi per inalazione di sevoflurane. Raccogliere 40-80 μL di sangue periferico dal seno retro-orbitale utilizzando tubi capillari di vetro eparinizzato e sospendere questo campione in 1 ml di PBS + eparina (1 U/mL) in tubi da 1,5 ml. Centrifugare la sospensione del sangue a 340 × g per 3 min a 4 °C. Scartare il supernatante e resospendare il pellet in 1 mL di PBS + 1,2% w/v dextran (200 kDa) per 45 min a temperatura ambiente. Trasferire il supernatante su un altro tubo da 1,5 ml e centrifugare a 340 × g per 3 min. Per lalisi dei globuli rossi, resuspend le cellule in 0,17 MNH 4Cl per 5 min. Centrifugare la sospensione cellulare 340 × g per 3 min a 4 °C. Rimondivare le cellule in 50 μL di tampone di colorazione contenente 0,3 μL di blocco Fc anti-mouse. Incubare questo campione a 4 °C per 5 min. Aggiungere i seguenti anticorpi per la colorazione marcatore di superficie: 0,3 μL di cd45-PE-Cy7 del mouse, 0,3 μL ter-119-PE-Cy7, 0,3 μL di CD45-BV421 umano, 0,3 μL di CD13-PE umano, 1,2 μL di CD33-PE umano, 0,3 μL di CD19-APC umano, 0,3 μL di CD3-APC-Cy7 umano. Incubare le cellule a 4 °C per 15 minuti. Lavare una volta con 1 mL di tampone di colorazione e centrifuga a 340 × g per 5 min a 4 °C. Scartare il supernatante e resospendare le cellule in 200 μL di tampone di colorazione + 0,1% v/v di PI. Trasferire la sospensione cellulare su una piastra a fondo piatto da 96 po ‘e acquisire dati utilizzando il citometro di flusso in modalità rapida con la modalità del campione mix attiva e un volume di assorbimento di 100 μL. Esportare i dati in formato FCS per l’analisi utilizzando software come FlowJo. Impostare il citometro di flusso. Acquisire i dati per i campioni in modalità rapida con la modalità campione mix e un volume di assorbimento di 100 μL. Esportare i dati in formato FCS per l’analisi utilizzando software come FlowJo.