Une méthode de culture pour maintenir les cellules souches hématopoïétiques humaines quiescentes

Le protocole suit les lignes directrices du National Center for Global Health and Medicine. Toutes les procédures expérimentales effectuées sur des souris sont approuvées par le Comité d’expérimentation animale du National Center for Global Health and Medicine.REMARQUE : Un aperçu du protocole est illustré à la figure 1. 1. Préparation lipidique Dissoudre les lipides suivants dans le méthanol dans les tubes de verre aux concentrations indiquées : palmitate de sodium, 16 mg/mL; oléate de sodium, 30 mg/mL; et le cholestérol, 4 mg/mL. Conserver la solution lipidique à -30 °C et décongeler l’échantillon avant utilisation. Mélanger les solutions lipidiques préparées à l’étape 1.1 dans un tube de verre frais aux doses nécessaires pour obtenir la concentration finale de 100 μg/mL de palmitate, 100 μg/mL d’oléate et 20 μg/mL de cholestérol. Par exemple, lors de la préparation de 10 mL de culture, mélanger 62,5 μL de solution palmitate, 33 μL de solution oléate, et 50 μL de solution de cholestérol dans le tube de verre. Évaporer le méthanol en passant du gaz azoté à travers la solution lipidique (figure 2A et 2B). Si le gaz azoté n’est pas disponible, passez l’air à travers la solution à l’aide d’une pipette-aid. Évaporez complètement le méthanol restant en chauffant le tube de verre dans un bain d’eau à 37 °C (figure 2C).REMARQUE : L’utilisation d’une forte concentration de gaz N2 dans l’espace confiné est potentiellement nocive. Bien que le volume utilisé dans le protocole pour évaporer le méthanol soit limité et donc considéré comme sûr, il est important de ventiler adéquatement la pièce et d’étiqueter les zones de concentrations potentiellement élevées de gaz N2 en cas de fuite de gaz inattendue. 2. Préparation moyenne Préparer le milieu Eagle modifié (DMEM)/F12 de Dulbecco (avec HEPES et glutamine). Ajouter la pénicilline et le sulfate de streptocycine au milieu à la concentration finale de 50 unités et 50 μg/mL, respectivement. Le milieu DMEM/F12 contenant des antibiotiques peut être conservé à 4 °C pendant au moins 2 mois. Ajouter 4 % w/v d’albumine de sérum bovin (BSA) au milieu Eagle modifié (DMEM)/F12 de Dulbecco (avec HEPES et glutamine). Réglez le pH du milieu au pH 7.4-7.8 en utilisant la solution NaOH, généralement au pH 7.6. Ajouter le milieu au tube de verre préparé à l’étape 1. Pour parvenir à une solution avec une solubilité maximale, l’ajout de 3-15 mL moyen est recommandé. Dissoudre complètement les lipides par sonication (optimale : plus de 20 min de sonication). Après la dissolution de la BSA et des lipides, l’échantillon doit être stocké à -80 °C et utilisé dans les 2 mois. Décongeler immédiatement avant l’utilisation. Ajouter 1/1 000 du mélange d’insuline, de transferrine, de sélénite de sodium et d’éthanol amine (ITS-X) au mélange DMEM/F12. Filtrer le milieu mixte à l’aide d’un filtre de 0,22 μm (désigné comme « média de culture »). Avant utilisation, ajouter le facteur de cellules souches humaines (SCF) et la thrombopoïétine humaine (TPO) aux médias de culture à une concentration finale de 3 ng/mL chacune. Après avoir ajouté les cytokines et ITS-X, le milieu ne peut pas être stocké. Tampon de coloration : Ajouter 10 % de FCS à la solution saline tamponnée de phosphate (PBS) sans ca et mg. Cette solution peut être stockée à 4 °C pendant 2 semaines. Décongeler les supports : Ajouter 10 % de FCS au DMEM/F12. Cette solution est à usage unique. Solution de stock de cytokine : Dissoudre chaque SCF humain ou TPO humain dans PBS (Ca- et Mg-free) à 20 μg/mL. Cette solution peut être stockée à -80 °C pendant au moins un an sans perte d’activité. Une fois décongelée, conserver la solution de bouillon à 4 °C et l’utiliser dans un délai de 1 mois.REMARQUE : Examinez le lot après chaque achat afin d’éviter toute variation des contaminants dans la BSA. Culture HSCs en même temps avec différents lots de BSA et d’examiner le nombre phénotypique HSC au jour 7 comme décrit ci-dessous. Si un lot bsa montre un faible nombre ou fréquence de cellules CD34+ (par exemple moins de la moitié du nombre de cellules d’entrée), évitez d’utiliser ce lot. 3. Préparation de la moelle osseuse humaine CD34+ cellules Achetez des cellules humaines CD34+ moelle osseuse et stockez les cellules dans de l’azote liquide jusqu’à utilisation. Alternativement, les cellules de moelle osseuse d’un volontaire en bonne santé ou de cellules sanguines fraîches de cordon ombilical peuvent être utilisées sur approbation par le comité éthique de l’institut et le consentement du donneur. Réchauffer 10 mL de décongeler les supports dans un tube conique de 15 mL dans un bain d’eau de 37 °C. Décongeler les cellules congelées dans des flacons dans un bain d’eau de 37 °C dans les 2 minutes. Après avoir essuyé le flacon avec 70 % d’éthanol pour éliminer les contaminants, transférez les cellules dans le tube conique de 15 mL contenant le milieu préchauffé à partir de l’étape 3.2. Centrifugeuse le tube de 15 mL à 200 × g pendant 15 min à température ambiante. Aspirer soigneusement le supernatant pour garder la pastille intacte (en laissant < 50 μL de milieu). Resuspendez les cellules avec le milieu restant et transférez-les dans un tube de 1,5 mL sur la glace.REMARQUE : L’exposition à des échantillons d’origine humaine directement dans la muqueuse, y compris l’œil ou les tissus blessés, peut causer une infection par des agents pathogènes connus ou inconnus; ainsi, les gants et les lunettes sont recommandés lors de la manipulation des cellules humaines. Même si les CD34 + cellules achetéessont négatifs pour le virus de l’hépatite B (VHB), le virus de l’hépatite C (VHC) et le virus de l’immunodéficience humaine 1 (VIH1), une surveillance attentive devrait être effectuée conformément aux lignes directrices institutionnelles en cas d’incidence d’exposition. Suivez les directives institutionnelles lors de l’élimination des matériaux exposés aux cellules humaines. 4. Tri des HSC Étiquetez les cellules avec des anticorps conjugués au fluorochrome. Mélangez 50 μL de tampon de coloration plus 10 μL d’anti-CD34-FITC, 2 μL d’anti-CD38-PerCP-Cy5.5, 5 μL d’anti-CD90-PE-Cy7 et 10 μL d’anti-CD45RA-PE. Resuspendez la pastille cellulaire dans le mélange d’anticorps. Incuber les cellules pendant 30 min à 4 °C dans l’obscurité. Ajouter 1 mL de tampon de coloration pour laver les anticorps. Centrifugeuse les tubes à 340 × g pendant 5 min à 4 °C. Jeter le surnatant. Resuspendez la pastille cellulaire dans 0,5 mL de tampon de coloration + 0,1% d’iodure de propidium. Transférer la suspension dans un tube de 5 mL à l’aide d’un filtre de 40 μm. Portez les HSC phénotypiques dans le PI-CD34+CD38-CD90+CD45RA- fraction utilisant le FACS Aria-IIIu et triez les cellules dans un tube de 1,5 mL rempli de 500 μL de médias culturels (Figure 3). À l’aide de la stratégie de gating indiquée à la figure 3,on s’attend à ce que ~10 % des cellules CD34+ soient phénotypiques. Enregistrez le numéro de cellule trié pour calculer le volume de médias pour résuspendre les cellules à l’étape 5.3.REMARQUE : La stratégie de blocage est exécutée comme décritprécédemment 16 tout en omettant la tache de marqueur de lignée étant donné la faible expression des marqueurs de lignée dans le CD34+CD38- fraction des individus en bonne santé17. Centrifugeuse les cellules triées à 340 × g pendant 5 min à 4 °C et jeter le supernatant. Aspirez soigneusement le surnatant pour s’assurer que la pastille reste intacte. Conserver les cellules triées sur la glace jusqu’à la culture.REMARQUE : La compensation par fluorescence du chevauchement spectral devrait être effectuée au cours de la première expérience. 5. Culture cellulaire Transférer 200 μL des supports de culture contenant des cytokines préparées à l’étape 2 dans des plaques à fond plat de 96 puits. Pour éviter l’évaporation du milieu, remplissez tous les puits inutilisés de 100 à 200 μL de PBS. Resuspendez les HSC triés dans les médias de culture sans cytokines à 60 cellules/μL. Aliquot 600 HSCs/puits (10 μL de suspension cellulaire) dans chaque puits. Le numéro de cellule peut être modifié. Moins de 300 cellules entraîneront une plus grande variation technique, et donc plus de puits par condition sont nécessaires pour détecter les différences biologiques. La culture de plus de 1000 cellules dans un seul puits doit être évitée en raison de la privation de cytokine/nutriments ou de l’accumulation de cytokines/chimiokines défavorables. Culture des cellules dans un incubateur multi-gaz humidifié à 37 °C dans une atmosphère de CO2 à 5 % et de 1 % o2. Pour les cultures de plus de 7 jours, le remplacement de la moitié du volume des médias tous les 3-4 jours est recommandé. Aspirez soigneusement 100 μL de médias par pipetage et ajoutez 100 μL de supports de culture nouvellement préparés contenant des cytokines à chaque puits. Les médias culturels doivent être préchauffés à 37 °C. 6. Analyse des phénotypes marqueurs à l’aide de la cytométrie du débit REMARQUE : Bien que les cellules doivent être analysées après 7 jours de culture, la durée de la culture peut être modifiée. Jeter 170 μL du milieu à l’aide d’une pipette à 8 canaux. Étiquetez les cellules avec le mélange d’anticorps. Mélanger 0,5 μL d’anti-CD34-FITC, 0,1 μL d’anti-CD38-PerCP-Cy5.5, 0,25 μL d’anti-CD90-PE-Cy7, 0,5 μL d’anti-CD45RA-PE et 9 μL de tampon de coloration par puits. Ajouter 10 μL du mélange à la plaque de 96 puits et incuber les cellules pendant 30 min à 4 °C dans l’obscurité. Pour laver les anticorps, ajouter 100 μL de tampon de coloration aux puits et centrifuger les plaques à 400 × g pendant 5 min à 4 °C à l’aide d’une faible accélération et d’une décélération moyenne. Aspirez soigneusement 100 μL du supernatant pour maintenir les cellules au fond des puits, puis résuspendez les cellules dans 200 μL de tampon de coloration + 0,1 % v/v de PI + 1 % v/v de microsphériques fluorescentes (p. ex., fluorosphères flow-check). Configurer l’instrument de cytométrie d’écoulement. Obtenez des données pour les échantillons en mode rapide avec un mode échantillon mixte sur et des volumes d’absorption de 100 μL. Exportez les données au format FCS et analysez-les à l’aide de logiciels tels que FlowJo. Les numéros de cellules peuvent être déterminés à l’aide du nombre de perles de microsphère fluorescente. Par exemple, si le chercheur ajoute 2000 perles par puits et que le nombre de perles est de 700, multipliez le nombre de cellules de chaque fraction d’ici 2000/700 pour estimer le nombre total de cellules de la fraction dans le puits.REMARQUE : Les microsphériques fluorescents sont toxiques pour les cellules de culture en raison de la présence de formaldéhyde. Cela peut induire la mort cellulaire pendant l’analyse. Réduire au minimum le nombre de puits (<50 puits) analysés en permanence afin d’éviter les biais. 7. Transplantation de HSC humains REMARQUE : L’activité de repeuplement des cellules de culture est validée par transplantation à des souris immunodéficientes. Toutes les procédures doivent être approuvées par des comités d’expérimentation animale ou leurs équivalents. En tant que donneurs, préparez un nombre suffisant de souris immunodéficientes nod-SCID-Il2rg-null (NOG) de 8 à 12 semaines. Comme les souris NOG sont très sensibles à l’infection, gardez les cages de reproduction aussi propres que possible et nourrissez les souris avec un régime et de l’eau stérilisés. Culture d’un nombre suffisant de CSS pour la transplantation tel que décrit à l’étape 5. Par exemple, lorsque 5 000 HSC (équivalent jour 0) sont transplantés sur 6 souris receveurs, la culture est de 35 000 à 40 000 HSC dans 40 puits d’une plaque de 96 puits (200 μL de culture par puits) ou dans 8 puits d’une plaque de 24 puits (1 mL de culture par puits). Culture des cellules pendant 2 semaines avec des changements demi-médias tous les 3-4 jours dans un incubateur multi-gaz humidifié à 37 °C avec 5% de CO2 et 1% O2. La durée de la culture peut être modifiée. Irradier les souris NOG à 2,5 Gy à 6-24 h avant la transplantation. Recueillir les HSC cultivés dans des tubes de 1,5 mL. Centrifugeuse les tubes à 340 ×g pendant 5 min à 4°C. Aspirez soigneusement les supernatants et résuspendez les cellules dans un tampon stérile de coloration glacée à une densité cellulaire de 5 000 HSC (équivalent jour 0) par 200 μL. Transférez cette suspension dans des tubes en polypropylène de 3 mL. Pour stériliser le tampon de coloration, filtrez-le à l’aide d’un filtre de 0,22 μm. Avant la transplantation, anesthésier les souris par inhalation de sevoflurane ou d’isoflurane. Pour transplanter 5000 HSC cultivés (équivalent jour 0), injectez 200 μL de la suspension cellulaire dans la veine de la queue ou sinus orbital rétro de souris NOG irradiées à l’étape 7.1 à l’aide d’une seringue de 1 mL et d’une aiguille de calibre 27. Les CSS de moelle osseuse fraîchement isolés ou décongelés peuvent être transplantés comme un contrôle. Les gants doivent être stérilisés avec 70 % d’éthanol v/v entre chaque intervention. 8. Analyse de la fréquence des cellules d’origine humaine dans le sang périphérique Pour examiner le repeuplement des cellules humaines, recueillir le sang périphérique à 1, 2 et 3 mois après la transplantation. Avant de recueillir le sang périphérique, anesthésier les souris par inhalation de sevoflurane. Recueillir 40-80 μL de sang périphérique du sinus rétro-orbital à l’aide de tubes capillaires en verre héparinisé et suspendre cet échantillon en 1 mL de PBS + héparine (1 U/mL) dans des tubes de 1,5 mL. Centrifugeuse de la suspension sanguine à 340 × g pendant 3 min à 4 °C. Jeter le supernatant et résuspendre la pastille en 1 mL de PBS + 1,2% w/v dextran (200 kDa) pendant 45 min à température ambiante. Transférer le supernatant dans un autre tube de 1,5 mL et une centrifugeuse à 340 × g pendant 3 min. Pour la lyse des globules rouges, resuspendez les cellules en 0,17 M NH4Cl pendant 5 min. Centrifugeuse la suspension cellulaire 340 × g pendant 3 min à 4 °C. Resuspendez les cellules dans 50 μL de tampon de coloration contenant 0,3 μL d’anti-souris Fc-bloc. Incuber cet échantillon à 4 °C pendant 5 min. Ajouter les anticorps suivants pour la coloration des marqueurs de surface : 0,3 μL de souris CD45-PE-Cy7, 0,3 μL souris Ter-119-PE-Cy7, 0,3 μL de CD45-BV421 humain, 0,3 μL de CD13-PE humain, 1,2 μL de CD33-PE humain, 0,3 μL de CD19-APC humain, 0,3 μL de CD3-APC-Cy7 humain. Incuber les cellules à 4 °C pendant 15 min. Laver une fois avec 1 mL de tampon de coloration et centrifugeuse à 340 × g pendant 5 min à 4 °C. Jetez le supernatant et resuspendez les cellules dans 200 μL de tampon de coloration + 0,1% v/v de PI. Transférez la suspension cellulaire dans une plaque à fond plat de 96 puits et obtenez des données à l’aide du cytomètre d’écoulement en mode rapide avec le mode échantillon mix et un volume d’absorption de 100 μL. Exportez les données au format FCS pour analyse à l’aide de logiciels tels que FlowJo. Configurer le cytomètre d’écoulement. Obtenez des données pour les échantillons en mode rapide avec le mode échantillon mix et un volume d’absorption de 100 μL. Exportez les données au format FCS pour analyse à l’aide de logiciels tels que FlowJo.