Sessiz İnsan Hematopoetik Kök Hücrelerini Korumak İçin Bir Kültür Yöntemi

Protokol, Ulusal Küresel Sağlık ve Tıp Merkezi’nin yönergelerine uyar. Fareler üzerinde yapılan tüm deneysel prosedürler Ulusal Küresel Sağlık ve Tıp Merkezi hayvan deney komitesi tarafından onaylanmıştır.NOT: Protokole genel bir bakış Şekil 1’de gösterilmiştir. 1. Lipid hazırlığı Aşağıdaki lipitleri belirtilen konsantrasyonlarda cam tüplerde metanolde çözün: sodyum palmitat, 16 mg / mL; sodyum oleat, 30 mg/mL; ve kolesterol, 4 mg/ mL. Lipid çözeltisini -30 °C’de saklayın ve kullanmadan önce numuneyi çözün. 1.1. adımda hazırlanan lipid çözeltilerini, 100 μg/mL palmitat, 100 μg/mL oleat ve 20 μg/mL kolesterolün son konsantrasyonunu elde etmek için gerekli dozlarda taze bir cam tüpte karıştırın. Örneğin, 10 mL kültür ortamı hazırlarken, cam tüpte 62,5 μL palmitat çözeltisi, 33 μL oleat çözeltisi ve 50 μL kolesterol çözeltisini karıştırın. Azot gazını lipit çözeltisi(Şekil 2A ve 2B)ile geçirerek metanol buharlaştırın. Azot gazı yoksa, pipet yardımı kullanarak çözeltiden hava geçirin. Cam tüpü 37 °C’de bir su banyosunda ısıtarak kalan metanolleri tamamenbuharlaştır (Şekil 2C).NOT: Kapalı alanda yüksek konsantrasyondaN 2 gazı kullanımı potansiyel olarak zararlıdır. Metanol buharlaşmak için protokolde kullanılan hacim sınırlı olmasına ve bu nedenle güvenli olarak kabul edilmesine rağmen, beklenmedik bir gaz sızıntısı meydana gelmesi durumunda odanın yeterince havalandırılması ve potansiyel olarak yüksek konsantrasyonlarda N2 gazının etiketlenme alanları önemlidir. 2. Orta hazırlık Dulbecco’nun modifiye Eagle orta (DMEM)/F12 ortamını (HEPES ve glutamin ile) hazırlayın. Orta ila son konsantrasyona sırasıyla 50 birim ve 50 μg/ mL’lik penisilin ve streptomisin sülfat ekleyin. Antibiyotik içeren DMEM/F12 ortamı en az 2 ay boyunca 4 °C’de saklanabilir. Dulbecco’nun modifiye Eagle ortamına (DMEM)/F12 ortamına (HEPES ve glutamin ile) %4 w/v sığır serum albümini (BSA) ekleyin. NaOH çözümünü kullanarak ortamın pH’ını pH 7.4-7.8’e ayarlayın, genellikle pH 7.6’ya ayarlayın. 1. adımda hazırlanan cam boruya ortamı ekleyin. Maksimum çözünürlüğe sahip bir çözüm elde etmek için 3-15 mL ortam eklenmesi önerilir. Lipitleri sonication ile tamamen çözün (optimal: 20 dakikadan fazla sonication). BSA ve lipitler çözüldükten sonra, numune -80 °C’de saklanmalı ve 2 ay içinde kullanılmalıdır. Kullanmadan hemen önce çözün. DMEM/F12’ye insülin, transferrin, sodyum selenit ve etanol amin (ITS-X) karışımının 1/1.000’ini ekleyin. Karışık ortamı 0,22 μm filtre kullanarak filtreleyin (“kültür ortamı” olarak belirlenmiştir). Kullanmadan önce, kültür ortamına her biri 3 ng/mL’lik son konsantrasyonda insan kök hücre faktörü (SCF) ve insan trombopoietin (TPO) ekleyin. Sitokinler ve ITS-X ekledikten sonra ortam depolanamaz. Boyama tamponu: Ca ve Mg içermeyen fosfat tamponlu saline (PBS) FCS ekleyin. Bu çözelti 2 hafta boyunca 4 °C’de saklanabilir. Çözülmüş ortam: DMEM/F12’ye FCS ekleyin. Bu çözüm tek kullanımlıktır. Sitokin stok çözeltisi: Her bir insan SCF’sini veya insan TPO’larını PBS’de (Ca- ve Mg-free) 20 μg/ mL’de çözün. Bu çözelti -80 °C’de aktivite kaybı olmadan en az bir yıl saklanabilir. Çözdükten sonra, stok çözeltisini 4 °C’de saklayın ve 1 ay içinde kullanın.NOT: BSA’daki kirleticilerin değişimini önlemek için her satın alma işleminden sonra lotu inceleyin. Farklı BSA partileri ile aynı anda kültür HSC’leri ve aşağıda açıklandığı gibi 7. BSA toplu işlemi CD34+ hücrelerinin düşük bir sayısını veya sıklığını gösteriyorsa (örneğin, giriş hücresi sayısının yarısından az), bu toplu işlemi kullanmaktan kaçının. 3. İnsan kemik iliği CD34+ hücrelerinin hazırlanması İnsan CD34+ kemik iliği hücreleri satın alın ve hücreleri kullanıma kadar sıvı nitrojende saklayın. Alternatif olarak, sağlıklı bir gönüllüden veya taze kordon kan hücrelerinden alınan kemik iliği hücreleri, enstitü etik komitesinin onayı ve donör onayı ile kullanılabilir. 37 °C’lik su banyosunda 15 mL konik tüpte 10 mL çözünme ortamı ısıtın. Donmuş hücreleri 2 dakika içinde 37 °C’lik bir su banyosunda şişelerde çözün. Kirleticileri gidermek için şişeyi% 70 etanol ile sildikten sonra, hücreleri adım 3.2’den önceden ısıtılmış ortamı içeren 15 mL konik tüpe aktarın. 15 mL’lik tüpü oda sıcaklığında 15 dakika boyunca 200 × g’da santrifüjlayın. Peletin sağlam kalması için süpernatantı dikkatlice emiş edin (< 50 μL orta bırakır). Kalan ortamla hücreleri yeniden biriktirin ve buz üzerinde 1,5 mL'lik bir tüpe aktarın.NOT: Göz veya yaralı doku da dahil olmak üzere doğrudan mukozada insan kaynaklı örneklere maruz kalmak, bilinen veya bilinmeyen patojenler tarafından enfeksiyona neden olabilir; bu nedenle, insan hücrelerini kullanırken eldiven ve gözlük önerilir. Satın alınan CD34+ hücreleri hepatit B virüsü (HBV), hepatit C virüsü (HCV) ve insan immün yetmezlik virüsü 1 (HIV1) için negatif test etse bile, maruz kalma insidansı meydana gelirse kurumsal yönergelere göre dikkatli izleme yapılmalıdır. İnsan hücrelerine maruz kalan malzemeleri elden çıkarmak için kurumsal kurallara uyun. 4. HSC’leri Sıralama Hücreleri florokrom konjuge antikorlarla etiketle. 50 μL boyama tamponu artı 10 μL anti-CD34-FITC, 2 μL anti-CD38-PerCP-Cy5.5, 5 μL anti-CD90-PE-Cy7 ve 10 μL anti-CD45RA-PE karıştırın. Hücre peletini antikor karışımına yeniden koyun. Karanlıkta 4 °C’de hücreleri 30 dakika kuluçkaya yatırın. Antikorları yıkamak için 1 mL boyama tamponu ekleyin. Tüpleri 340 × g’da 4 °C’de 5 dakika santrifüj edin. Üstnatant atın. Hücre peletini 0,5 mL boyama tamponu + % 0,1 propidium iyodür içinde yeniden sunun. Süspansiyonu 40 μm filtre kullanarak 5 mL’lik bir tüpe aktarın. PI – CD34 + CD38-CD90+CD45RA- fraksiyonu içindeki FENotipik HSC’leri FACS Aria-IIIu kullanarak kapılayın ve hücreleri 500 μL kültür ortamıyla dolu 1,5 mL’lik bir tüpe ayırın (Şekil 3). Şekil 3’te gösterilen gating stratejisini kullanarak, CD34+ hücrelerinin ~’unun fenotipik HSC’ler olması beklenir.NOT: Gating stratejisi, sağlıklı bireylerden CD34 + CD38- fraksiyonundaki soy işaretleyicilerin düşük ifadesi göz önüne alındığında soy işaretleyici lekeleme atlanırken daha önce açıklandığı gibi16 olarak gerçekleştirilir17 . Sıralanmış hücreleri 340 × g’da 4 °C’de 5 dakika santrifüj edin ve süpernatantı atın. Peletin sağlam kalmasını sağlamak için süpernatantı dikkatlice emiş edin. Sıralanmış hücreleri kültüre kadar buzda saklayın.NOT: Spektral örtüşmenin floresan telafisi ilk deney sırasında yapılmalıdır. 5. Hücre kültürü 2. adımda hazırlanan sitokinleri içeren kültür medyasının 200 μL’sini düz tabanlı 96 kuyu plakalarına aktarın. Ortamın buharlaşmasını önlemek için, kullanılmayan tüm kuyuları 100-200 μL PBS ile doldurun. Sıralanmış HSC’leri 60 hücre/μL’de sitokin olmadan kültür ortamlarında yeniden biriktirin. Her kuyuya Aliquot 600 HSC/kuyu (10 μL hücre süspansiyonu). Hücre numarası değiştirilebilir. 300’den az hücre daha büyük teknik varyasyona yol açacaktır ve bu nedenle biyolojik farklılıkları tespit etmek için durum başına daha fazla kuyuya ihtiyaç vardır. Sitokin/besin yoksunluğu veya elverişsiz sitokin/kemokin birikimi nedeniyle tek bir kuyuda 1000’den fazla hücrenin kültlenmesinden kaçınılmalıdır. Hücreleri% 5 CO2 ve% 1 O2 atmosferde 37 ° C’de nemlendirilmiş çok gazlı bir inkübatörde kültüre edin. 7 günden büyük kültürler için, her 3-4 günde bir medya hacminin yarısının değiştirilmesi önerilir. Pipetleme ile 100 μL medyayı dikkatlice emiş ve her kuyuya sitokin içeren 100 μL yeni hazırlanmış kültür ortamı ekleyin. Kültür ortamı 37 °C’de önceden ısıtılmalıdır. 6. Akış sitometrisi kullanılarak marker fenotiplerinin analizi NOT: Hücrelerin 7 günlük kültürden sonra analiz edilmesi gerekirken, kültür süresi değiştirilebilir. 8 kanallı pipet kullanarak ortamın 170 μL’lik kısmını atın. Hücreleri antikor karışımı ile etiketleyin. 0,5 μL anti-CD34-FITC, 0,1 μL anti-CD38-PerCP-Cy5,5, 0,25 μL anti-CD90-PE-Cy7, 0,5 μL anti-CD45RA-PE ve kuyu başına 9 μL boyama tamponu karıştırın. Karışımın 10 μL’lik kısmını 96 kuyu plakasına ekleyin ve karanlıkta 4 °C’de 30 dakika boyunca hücreleri kuluçkaya yatırın. Antikorları yıkamak için kuyulara 100 μL boyama tamponu ekleyin ve plakaları düşük hızlanma ve orta yavaşlama kullanarak 4 °C’de 5 dakika boyunca 400 × g’da santrifüjleyin. Kuyuların altındaki hücreleri korumak için süpernatantın 100 μL’sini dikkatlice emiş, ardından hücreleri 200 μL boyama tamponunda + PI’nin% 0.1 v / v ‘ inde + floresan mikrokürelerin % 1 v / v’sinde (örneğin, Akış Kontrol Florosferleri) yeniden biriktirin. Akış sitometri aletini ayarlayın. 100 μL’lik karışık numune modu açık ve alım hacimleri ile numuneler için hızlı modda veri alın. Verileri FCS biçiminde dışa aktarın ve FlowJo gibi bir yazılım kullanarak analiz edin. Hücre numaraları floresan mikroküreci boncuk sayısı kullanılarak belirlenebilir. Örneğin, araştırmacı kuyu başına 2000 boncuk eklerse ve boncuk sayısı 700 ise, kuyudaki kesirin toplam hücre sayısını tahmin etmek için her kesirdeki hücre sayısını 2000/700 ile çarpın.NOT: Floresan mikroküreler formaldehit varlığı nedeniyle kültürlü hücreler için toksiktir. Bu, analiz sırasında hücre ölümüne neden olabilir. Önyargıyı önlemek için sürekli analiz edilen kuyu sayısını (<50 kuyu) en aza indirin. 7. İnsan HSC’lerinin nakli NOT: Kültürlü hücrelerin repopülasyon aktivitesi immün yetmez farelere nakil ile doğrulanır. Tüm prosedürler hayvan deney komiteleri veya eşdeğerleri tarafından onaylanmalıdır. Donör olarak, yeterli sayıda 8-12 haftalık immün yetmezlik nod-SCID-Il2rg-null (NOG) fare hazırlayın. NOG fareleri enfeksiyona karşı oldukça hassas olduğundan, üreme kafeslerini mümkün olduğunca temiz tutun ve fareleri sterilize edilmiş bir diyet ve su ile besleyin. 5. adımda açıklandığı gibi transplantasyon için yeterli sayıda HSC kültürü. Örneğin, 5000 HSC (0. gün eşdeğeri) 6 alıcı fareye nakledildiğinde, kültür 35.000-40.000 HSC’yi 96 kuyu plakasının 40 kuyusunda (kuyu başına 200 μL kültür ortamı) veya 24 kuyu plakasının 8 kuyusunda (kuyu başına 1 mL kültür medyası). %5 CO 2 ve %1O2 ile 37 °C’de nemlendirilmiş çok gazlı bir inkübatörde her 3-4 günde bir yarım ortam değişiklikleri ile hücreleri2 hafta boyunca kültürlendirin. Kültür süresi değiştirilebilir. NOG farelerini nakilden önce 6-24 saat 2.5 Gy’de ışınla. Kültürlü HSC’leri 1,5 mL tüplerde toplayın. Tüpleri 340 ×g’da 4°C’de 5 dakika santrifüj edin. Süpernatantları dikkatlice emiş edin ve steril buz gibi boyama tamponundaki hücreleri 200 μL başına 5000 HSC (gün 0 eşdeğeri) hücre yoğunluğunda yeniden depola. Boyama tamponu sterilize etmek için 0,22 μm filtre kullanarak filtreleyin. Transplantasyondan önce, fareleri sevofluran veya izofluran inhalasyonu ile uyuşturun. 5000 kültürlü HSC’yi (0. gün eşdeğeri) nakletmek için, 1 mL şırınga ve 27-gauge iğne kullanarak 7.1 adımında ışınlanan NOG farelerinin kuyruk damarına veya retro orbital sinüsüne 200 μL hücre süspansiyonu enjekte edin. Yeni izole edilmiş veya çözülmüş kemik iliği HSC’leri kontrol olarak nakledilebilir. Eldivenler her işlem arasında v/v etanol ile sterilize edilmelidir. 8. Periferik kandaki insan kaynaklı hücrelerin sıklığının analizi İnsan hücrelerinin yeniden çoğalmasını incelemek için, periferik kanı transplantasyondan 1, 2 ve 3 ay sonra toplayın. Periferik kanı toplamadan önce, fareleri sevoflurane inhalasyon ile uyuşturun. Heparinize cam kılcal tüpler kullanarak retro-orbital sinüsten 40-80 μL periferik kan toplayın ve bu örneği 1,5 mL tüplerde 1 mL PBS + heparin (1 U/mL) olarak askıya alın. Kan süspansiyonu 340 × g’da 4 °C’de 3 dakika santrifüj. Süpernatant atın ve peleti oda sıcaklığında 45 dakika boyunca 1 mL PBS + % 1,2 w/v dektran (200 kDa) olarak yeniden depolayın. Süpernatantı 3 dakika boyunca 340 × g’da başka bir 1,5 mL tüpe ve santrifüje aktarın. Kırmızı kan hücresi lizisi için, hücreleri 0.17 M NH 4 Cl’de5dakika boyunca yeniden biriktirin. Hücre süspansiyonu 4 °C’de 3 dakika boyunca 340 × g santrifüj. Hücreleri 0,3 μL anti-fare Fc bloğu içeren 50 μL boyama tamponunda yeniden kullanın. Bu numuneyi 4 °C’de 5 dakika kuluçkaya yatır. Yüzey işaretleyici boyama için aşağıdaki antikorları ekleyin: 0,3 μL fare CD45-PE-Cy7, 0,3 μL fare Ter-119-PE-Cy7, 0.3 μL insan CD45-BV421, 0.3 μL insan CD13-PE, 1.2 μL insan CD33-PE, 0.3 μL insan CD19-APC, 0.3 μL insan CD3-APC-Cy7. Hücreleri 4 °C’de 15 dakika kuluçkaya yatırın. 4 °C’de 5 dakika boyunca 340 × g’da 1 mL boyama tamponu ve santrifüj ile bir kez yıkayın. Süpernatant atın ve hücreleri 200 μL boyama tamponu + %0,1 v/v PI’de yeniden biriktirin. Hücre süspansiyonu 96 kuyulu düz tabanlı bir plakaya aktarın ve mix numune modu açık ve 100 μL’lik bir alım hacmi ile akış sitometresini hızlı modda kullanarak veri elde edin. FlowJo gibi yazılımları kullanarak analiz için verileri FCS biçiminde dışa aktarabilirsiniz. Akış sitometresini kurun. Mix numune modu açık ve 100 μL’lik bir alım hacmi ile numuneler için verileri hızlı modda elde edin. FlowJo gibi yazılımları kullanarak analiz için verileri FCS biçiminde dışa aktarabilirsiniz.