Determinación rápida de la afinidad anticuerpos-antígenos por fotometría de masas

Los anticuerpos se han convertido en herramientas omnipresentes de la biología molecular y se utilizan ampliamente en aplicaciones médicas y de investigación. En medicina, son de vital importancia en el diagnóstico, pero sus aplicaciones terapéuticas también se están expandiendo y constantemente se desarrollan nuevas terapias basadas en anticuerpos^1,2,3,4. Las aplicaciones científicas de los anticuerpos incluyen muchas técnicas de laboratorio indispensables como la inmunofluorescencia^5,la inmunoprecipitación^6,la citometría de flujo^7,ELISA e hinchazón occidental. Para cada una de estas aplicaciones, es de crucial importancia obtener mediciones precisas de las propiedades de unión del anticuerpo, incluida la afinidad y especificidad de unión.

Desde que se introdujo el primer instrumento de resonancia de plasmon de superficie comercial (SPR) en 1990, los biosensores ópticos se han convertido en el “estándar de oro” de caracterización de anticuerpos, pero otras técnicas, incluyendo ELISA, también se utilizan rutinariamente para medir las afinidades de anticuerpos^8,9. Estos métodos generalmente requieren inmovilización o etiquetado de las moléculas analizadas, lo que puede afectar potencialmente la interacción de interés. También son relativamente lentos, lo que implica varios pasos de ensayo antes de que los resultados se puedan recopilar para el análisis de datos. Un método de una sola molécula desarrollado recientemente, la fotometría de masas (MP), detecta moléculas directamente en la solución cuando aterrizan en la superficie del microscopio cubrep^10,11. La detección óptica basada en dispersión de luz que emplea MP no requiere etiquetado o modificación de proteínas. Las moléculas de proteínas individuales se registran mediante el microscopio de dispersión interferométrico como manchas oscuras que aparecen en la imagen(Figura 1D),y varios miles de moléculas se pueden detectar durante la adquisición de datos de un minuto¹². La señal generada por cada partícula individual se cuantifica y se calcula su valor de contraste (oscuridad relativa). Los valores de contraste interferométrico son proporcionales a las masas moleculares de las proteínas, lo que permite la identificación de especies unidas y libres en la mezcla antígeno-anticuerpo. Al mismo tiempo, contando los eventos de aterrizaje molecular, MP mide directamente las poblaciones de especies. Esto proporciona a los métodos basados en MP una capacidad única para cuantificar de forma independiente las afines de varios sitios de enlace.

La unión de las moléculas de antígeno (Ag) a los dos sitios de unión del anticuerpo intacto (Ab) se puede describir como:

con las constantes de asociación de equilibrio K_a1 y K_a2 definidas como:

donde c_i y f_i representan la concentración y fracción del componente i, respectivamente. La concentración total de antígenos (c_Ag)_tot puede expresarse como:

Dado que se conocen las concentraciones totales del anticuerpo (c_Ab)_tot y antígeno (c_Ag)_tot, esta ecuación se puede utilizar para ajustar directamente las fracciones de componentes experimentales obtenidas de las mediciones MP y calcular las constantes de asociación de equilibrio K_a1 y K_a2 (ver Información complementaria).

Los datos MP también se pueden utilizar para estimar la cooperatividad entre los dos sitios de unión de anticuerpos¹¹. Para dos paratopos de anticuerpos con constantes de unión microscópicas idénticas, los factores estadísticos que describen el proceso de población de la Ab Ag y Ab? Loscomplejos Ag₂ dictan que las constantes de equilibrio macroscópicas aparentes K_a1 y K_a2 no serán numéricamente iguales, y K_a1 a 4K_a2. Por lo tanto, los valores experimentales de K_a1 < 4K_a2 indican una cooperación positiva entre los dos sitios de unión de anticuerpos. Del mismo modo, K_a1 > 4K_a2 indica una cooperación negativa.

Las mediciones MP de la afinidad de unión antígeno-anticuerpo son rápidas y requieren una pequeña cantidad de material. Las distribuciones de masa MP utilizadas para los cálculos constantes de equilibrio proporcionan información adicional sobre las propiedades de la muestra y permiten la evaluación de la pureza, la oligomerización y la agregación de la muestra en un solo experimento. El mismo método se puede utilizar para medir la unión entre proteínas y proteínas de alta afinidad, y MP es particularmente útil para estudios de interacciones multi-variables de proteínas. Los complejos multi proteico suelen tener grandes masas moleculares, óptimas para la detección de MP, y los datos de una sola molécula se pueden utilizar para medir la estequiometría y calcular las afinidades de múltiples sitios de unión simultáneamente. Esta información suele ser difícil de obtener mediante métodos basados en masa.

Sin modificaciones, el protocolo actual es adecuado para mediciones de interacciones submicromolares de relativamente alta afinidad con antígenos de una masa molecular de 20 kDa o más. Para obtener resultados óptimos, las existencias de proteínas deben ser de alta pureza, pero no hay requisitos específicos de amortiguación. Mediante el uso de MP, la unión antígeno-anticuerpos se puede evaluar en menos de cinco minutos. La recopilación y el análisis de datos necesarios para cálculos K_d precisos se pueden realizar en un plazo de 30 minutos.