التحديد السريع لتقارب الأجسام المضادة- المستضدات بواسطة القياس الضوئي الشامل
Summary
نحن وصف نهج جزيء واحد لقياسات تقارب الأجسام المضادة المضادة باستخدام القياس الضوئي الشامل (MP). البروتوكول المستندة إلى MP سريع ودقيق، ويستخدم كمية صغيرة جدا من المواد، ولا يتطلب تعديل البروتين.
Abstract
إن قياسات خصوصية وتقارب تفاعلات الأجسام المضادة للأجسام المضادة ذات أهمية حاسمة للتطبيقات الطبية والبحثية. في هذا البروتوكول، نحن وصف تنفيذ تقنية جزيء واحد جديد، قياس ضوئي الشامل (MP)، لهذا الغرض. MP هو تقنية خالية من التسمية والشل الحركة التي تكشف عن الكتل الجزيئية وفئات الأجسام المضادة ومجمعات الأجسام المضادة على مستوى جزيء واحد. MP يحلل عينة الأجسام المضادة للمضادات في غضون دقائق، مما يسمح لتحديد دقيق من تقارب ملزمة وفي وقت واحد توفير المعلومات عن علم التشنج والدولة القلية من البروتينات. هذا هو تقنية بسيطة ومباشرة التي تتطلب سوى بيكومويل كميات من البروتين والمواد الاستهلاكية لا مكلفة. ويمكن استخدام نفس الإجراء لدراسة البروتين البروتين ملزمة للبروتينات مع كتلة الجزيئية أكبر من 50 كيلو Da. للتفاعلات البروتينية المتعددة التكافؤ، يمكن الحصول على تقارب مواقع الربط المتعددة في قياس واحد. ومع ذلك، فإن طريقة قياس الجزيء الواحد وعدم وجود العلامات تفرض بعض القيود التجريبية. هذه الطريقة تعطي أفضل النتائج عند تطبيقها على قياسات تقارب التفاعل دون ميكرومولار، مستضدات مع كتلة جزيئية من 20 كيلو أم أيه أو أكبر، و نقي نسبيا عينات البروتين. كما أننا نُصف الإجراء اللازم لتنفيذ خطوات التركيب والحساب المطلوبة باستخدام برنامج تحليل البيانات الأساسي.
Introduction
أصبحت الأجسام المضادة أدوات في كل مكان من البيولوجيا الجزيئية وتستخدم على نطاق واسع في كل من التطبيقات الطبية والبحثية. في الطب، فهي ذات أهمية حاسمة في التشخيص، ولكن تطبيقاتها العلاجية تتوسع أيضاً ويتم تطوير العلاجات الجديدة القائمة على الأجسام المضادة باستمرار1،2،3،4. وتشمل التطبيقات العلمية للأجسام المضادة العديد من التقنيات المختبرية التي لا غنى عنها مثل immunofluorescence5، المناعي6، تدفق cytometry7، ELISA ، والنشاف الغربية. بالنسبة لكل من هذه التطبيقات، فإن الحصول على قياسات دقيقة لخصائص الربط للجسم المضاد، بما في ذلك تقارب الربط وخصوصيته، أمر بالغ الأهمية.
منذ أول جهاز الرنين البلازمون سطح التجارية (SPR) تم إدخالها في عام 1990، أصبحت أجهزة الاستشعار الحيوي البصرية “المعيار الذهبي” لتوصيف الأجسام المضادة، ولكن التقنيات الأخرى، بما في ذلك ELISA، تستخدم أيضا بشكل روتيني لقياس تقارب الأجسام المضادة8،9. هذه الطرق عادة ما تتطلب شل أو وضع العلامات على الجزيئات المحللة، والتي يمكن أن تؤثر على التفاعل بين الفائدة. كما أنها بطيئة نسبياً، وتنطوي على خطوات مقارنة متعددة قبل أن يتسنى جمع النتائج لتحليل البيانات. A وضعت مؤخرا واحد جزيء طريقة، القياس الضوئي الشامل (MP)، يكتشف الجزيئات مباشرة في الحل عندما تهبط على سطح المجهر يغطي10،11. لا يتطلب الكشف البصري القائم على تشتت الضوء الذي يستخدمه النائب وضع العلامات على البروتين أو تعديله. يتم تسجيل جزيئات البروتين الفردية بواسطة المجهر التشتت التداخلي كما البقع الداكنة التي تظهر في الصورة (الشكل 1D) ، ويمكن الكشف عن عدة آلاف من الجزيئات خلال الحصول على البيانات لمدة دقيقة واحدة12. يتم تحديد كمية الإشارة التي يتم إنشاؤها بواسطة كل جسيم على حدة، ويتم حساب قيمة التباين (ظلام نسبي). وتتناسب قيم التباين التداخلي مع الكتل الجزيئية للبروتينات، مما يسمح بتحديد الأنواع المقيدة والحرّة في خليط الأجسام المضادة للمضادات. في الوقت نفسه، من خلال عد أحداث الهبوط الجزيئي، MP يقيس مباشرة مجموعات الأنواع. وهذا يعطي MP الأساليب المستندة إلى قدرة فريدة لتحديد بشكل مستقل تقارب مواقع الربط المتعددة.
ربط المستضد (Ag) يمكن وصف جزيئات إلى موقعين ملزمين من الأجسام المضادة سليمة (Ab) كما :
مع الثوابت اقتران التوازن Ka1 و Ka2 تعريف ك:
حيث ci و fi تمثل التركيز وجزء من المكون i، على التوالي. يمكن التعبير عن تركيز المستضد الكلي (cAg)على النحو:
منذ تركيزات مجموع الأجسام المضادة (جAb)tot و antigen (cAg) من المعروفأن هذه المعادلة يمكن استخدامها لتناسب مباشرة الكسور المكون التجريبية التي تم الحصول عليها من قياسات MP وحساب ثوابت اقتران التوازن Ka1 و Ka2 (انظر المعلومات التكميلية).
ويمكن أيضا أن تستخدم بيانات MP لتقدير التعاون بين موقعين للجسم المضاد ملزمة11. لاثنان جسم مضادّة ثوابت مع ثوابت متماثلة مجهريّة ملزمة, العاملات إحصائيّة يصف العملية من مجموعة سكان من ال أب· Ag وAb· Ag2 المجمعات تملي أن الثوابت التوازن العيان واضح Ka1 و Ka2 لن تكون متساوية عدديا، وKa1 = 4Ka2. ولذلك، تشير القيم التجريبية لـ Ka1 < 4Ka2 إلى التعاون الإيجابي بين موقعي ربط الأجسام المضادة. وبالمثل، Ka1 > 4Ka2 يشير إلى التعاونية السلبية.
قياسات MP لتقارب الربط المضاد للجسم سريع ويتطلب كمية صغيرة من المواد. توفر التوزيعات الكتلة النائب المستخدمة في عمليات حسابية ثابتة التوازن معلومات إضافية حول خصائص العينة وتمكن من تقييم نقاء العينة، oligomerization، وتجميع في تجربة واحدة. ويمكن استخدام نفس الطريقة لقياس نسبة عالية من البروتين البروتين ملزمة، وMP مفيد بشكل خاص لدراسات التفاعلات البروتينية متعددة التكافؤ. وعادة ما يكون المجمعات متعددة البروتينات كتل جزيئية كبيرة، الأمثل للكشف عن النائب، ويمكن استخدام بيانات جزيء واحد لقياس stoichiometry وحساب تقارب مواقع الربط متعددة في وقت واحد. عادةً ما يصعب الحصول على هذه المعلومات باستخدام أساليب مجمعة.
دون تعديلات، والبروتوكول الحالي هو مناسبة لقياسات تقارب عالية نسبيا، تفاعلات دون micromolar مع مستضدات من كتلة جزيئية من 20 كيلو أم لا أو أكبر. للحصول على أفضل النتائج، يجب أن تكون مخزونات البروتين من درجة النقاء العالية، ولكن لا توجد متطلبات محددة العازلة. باستخدام MP، يمكن تقييم ربط الأجسام المضادة المضادة في أقل من خمس دقائق. يمكن إجراء جمع البيانات والتحليل المطلوبة لإجراء حسابات Kd دقيقة في غضون 30 دقيقة.
Protocol
Representative Results
Discussion
يوفر بروتوكول القياس الضوئي الشامل الموضح هنا طريقة سريعة ودقيقة لقياس تقاربات ربط الأجسام المضادة. يستخدم تحليل MP كمية صغيرة جدًا من المواد، ويمكن تقييم المعلومات الإضافية – بما في ذلك قياس الرزينة ، oligomerization ، والنقاء – من نفس البيانات (الشكل 5). دون تعديلات، وهذا الأسلوب ?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
نشكر كير نيومان على قراءته النقدية للمخطوطة. وقد دعم هذا العمل البرنامج داخل الأمعاء في المعهد الوطني للصحة.
Materials
| AcquireMP | Refeyn | MP data collection software | |
| Anti-human thrombin | Haematologic Technologies | AHT-5020 | RRID: AB_2864302 |
| Cotton-tipped applicators | Thorlabs | CTA10 | cotton optical swabs for lens cleaning |
| Coverslips 24×24 mm | Globe Scientific | 1405-10 | |
| Coverslips 24×50 mm | Fisher Scientific | 12-544-EP | |
| DiscoverMP | Refeyn | MP data processing software | |
| Forceps | Electron Microscopy Sciences | 78080-CF | soft-tipped forceps for coverslips handling |
| Human α-thrombin | Haematologic Technologies | HCT-0020 | |
| Immersion oil | Thorlabs | MOIL-30 | |
| Isopropanol | Alfa Aesar | 36644 | |
| Microsoft Excel | Microsoft | spreadsheet | |
| OneMP | Refeyn | Mass Photometry instrument | |
| Origin | OriginLab | scientific graphing software | |
| PBS | Corning | 46-013-CM | 10x stock |
| Syringe filter | Millipore | SLGSR33SS | buffer and sample filtering |
References
- Francis, R. J., et al. A phase I trial of antibody directed enzyme prodrug therapy (ADEPT) in patients with advanced colorectal carcinoma or other CEA producing tumours. British Journal of Cancer. 87 (6), 600-607 (2002).
- van Dyck, C. H. Anti-Amyloid-beta Monoclonal Antibodies for Alzheimer’s Disease: Pitfalls and Promise. Biological Psychiatry. 83 (4), 311-319 (2018).
- Vennepureddy, A., Singh, P., Rastogi, R., Atallah, J. P., Terjanian, T. Evolution of ramucirumab in the treatment of cancer – A review of literature. Journal of Oncology Pharmacy Practice. 23 (7), 525-539 (2017).
- Waldmann, T. A. Immunotherapy: past, present and future. Nature Medicine. 9 (3), 269-277 (2003).
- Huang, B., Bates, M., Zhuang, X. Super-resolution fluorescence microscopy. Annual Review of Biochemistry. 78, 993-1016 (2009).
- Rosenberg, M. I. . Protein Analysis and Purification. , (2005).
- Picot, J., Guerin, C. L., Le Van Kim, C., Boulanger, C. M. Flow cytometry: Retrospective, fundamentals and recent instrumentation. Cytotechnology. 64 (2), 109-130 (2012).
- Khan, S. H., Farkas, K., Kumar, R., Ling, J. A versatile method to measure the binding to basic proteins by surface plasmon resonance. Analytical Biochemistry. 421 (2), 385-390 (2012).
- Lofgren, J. A., et al. Comparing ELISA and surface plasmon resonance for assessing clinical immunogenicity of panitumumab. The Journal of Immunology. 178 (11), 7467-7472 (2007).
- Young, G., et al. Quantitative mass imaging of single biological macromolecules. Science. 360 (6387), 423-427 (2018).
- Wu, D., Piszczek, G. Measuring the affinity of protein-protein interactions on a single-molecule level by mass photometry. Analytical Biochemistry. 592, 113575 (2020).
- Cole, D., Young, G., Weigel, A., Sebesta, A., Kukura, P. Label-free single-molecule imaging with numerical-aperture-shaped interferometric scattering microscopy. ACS Photonics. 4 (2), 211-216 (2017).
- Soltermann, F., et al. Quantifying protein-protein interactions by molecular counting with mass photometry. Angewandte Chemie International Edition in English. 59 (27), 10774-10779 (2020).
- Kemmer, G., Keller, S. Nonlinear least-squares data fitting in Excel spreadsheets. Nature Protocols. 5 (2), 267-281 (2010).
