Détermination rapide de l’affinité anticorps-antigène par photométrie de masse

Les anticorps sont devenus des outils omniprésents de la biologie moléculaire et sont largement utilisés dans les applications médicales et de recherche. En médecine, ils sont d’une importance cruciale dans le diagnostic, mais leurs applications thérapeutiques sont également en expansion et de nouvelles thérapies à base d’anticorps sont constamment développés^1,2,3,4. Les applications scientifiques des anticorps incluent beaucoup de techniques indispensables de laboratoire telles que l’immunofluorescence^5,l’immunoprécipice^6,la cytométrie^{de flux 7,}ELISA, et le blotting occidental. Pour chacune de ces applications, l’obtention de mesures précises des propriétés contraignantes de l’anticorps, y compris l’affinité et la spécificité contraignantes, est d’une importance cruciale.

Depuis l’introduction du premier instrument commercial de résonance plasmon de surface (SPR) en 1990, les biocapteurs optiques sont devenus l’étalon-or de la caractérisation des anticorps, mais d’autres techniques, y compris l’ELISA, sont également couramment utilisées pour mesurer les affinités d’anticorps^8,9. Ces méthodes nécessitent généralement l’immobilisation ou l’étiquetage des molécules analysées, ce qui peut potentiellement affecter l’interaction d’intérêt. Ils sont également relativement lents, impliquant plusieurs étapes d’analyse avant que les résultats puissent être recueillis pour l’analyse des données. Une méthode à molécule unique récemment mise au point, la photométrie de masse (MP), détecte les molécules directement en solution lorsqu’elles atterrissent à la surface du microscope coverslip^10,11. La détection optique à base de diffusion de lumière que MP utilise ne nécessite pas d’étiquetage ou de modification des protéines. Les molécules protéiques individuelles sont enregistrées par le microscope de diffusion interférométrique comme des taches sombres apparaissant dans l’image (Figure 1D), et plusieurs milliers de molécules peuvent être détectées lors de l’acquisition de données d’une minute¹². Le signal généré par chaque particule individuelle est quantifié, et sa valeur de contraste (obscurité relative) est calculée. Les valeurs de contraste interférométriques sont proportionnelles aux masses moléculaires des protéines, ce qui permet l’identification d’espèces liées et libres dans le mélange antigène-anticorps. Dans le même temps, en comptant les événements d’atterrissage moléculaire, MP mesure directement les populations d’espèces. Cela donne aux méthodes basées sur mp une capacité unique de quantifier indépendamment les affinités de plusieurs sites de liaison.

La liaison des molécules del’antigène (Ag)aux deux sites de liaison de l’anticorps intact (Ab) peut être décrite comme :

avec l’association d’équilibre constantes K_a1 et K_{a2 définies} comme :

où c_i et f_i représentent la concentration et la fraction du composant i, respectivement. La concentration totale d’antigène( c_Ag)_tot peut être exprimée comme:

Étant donné que les concentrations totales de l’anticorps (c_Ab)_tot etantigène( c_Ag)_{tot sont} connus, cette équation peut être utilisée pour s’adapter directement aux fractions de composants expérimentaux obtenues à partir des mesures MP et calculer les constantes de l’association d’équilibre K_a1 et K_a2 (voir Information supplémentaire).

Les données MP peuvent également être utilisées pour estimer la cooperativité entre les deux sites de liaison d’anticorps¹¹. Pour deux paratopes d’anticorps avec des constantes microscopiques identiques de liaison, les facteurs statistiques décrivant le processus de population de l’Ab· Ag et Ab· Ag₂ complexes dictent que l’équilibre macroscopique apparent constantes K_a1 et K_a2 ne sera pas numériquement égal, et K_a1 = 4K_a2. Par conséquent, les valeurs expérimentales de K_a1 < 4K_a2 indiquent une cooperativité positive entre les deux sites de liaison d’anticorps. De même, K_a1 > 4K_{a2 indique} la cooperativité négative.

Les mesures mp de l’affinité de liaison antigène-anticorps sont rapides et nécessitent une petite quantité de matériel. Les distributions de masse MP utilisées pour les calculs constants d’équilibre fournissent des informations supplémentaires sur les propriétés de l’échantillon et permettent d’évaluer la pureté de l’échantillon, l’oligomérisation et l’agrégation en une seule expérience. La même méthode peut être utilisée pour mesurer la liaison protéine-protéine à haute affinité, et mp est particulièrement utile pour les études sur les interactions protéiques multi-valent. Les complexes multi-protéines ont généralement de grandes masses moléculaires, optimales pour la détection mp, et les données d’une molécule peuvent être utilisées pour mesurer la stoichiométrie et calculer les affinités de plusieurs sites de liaison simultanément. Ces informations sont généralement difficiles à obtenir à l’aide de méthodes en vrac.

Sans modifications, le protocole actuel convient aux mesures d’interactions sous-micromolaires relativement élevées avec des antigènes d’une masse moléculaire de 20 kDa ou plus. Pour des résultats optimaux, les stocks de protéines doivent être d’une grande pureté, mais il n’y a pas d’exigences spécifiques en matière de tampon. En utilisant MP, la liaison antigène-anticorps peut être évaluée en moins de cinq minutes. La collecte et l’analyse des données requises pour des calculs K_d précis peuvent être effectuées dans les 30 minutes.