Snelle bepaling van antilichaam-antigeen affiniteit door massa fotometrie

Antilichamen zijn alomtegenwoordige instrumenten van moleculaire biologie geworden en worden op grote schaal gebruikt in zowel medische als onderzoekstoepassingen. In de geneeskunde zijn ze van cruciaal belang in de diagnostiek, maar hun therapeutische toepassingen worden ook uitgebreid en nieuwe op antilichamen gebaseerde therapieën worden voortdurend ontwikkeld^1,2,3,4. De wetenschappelijke toepassingen van antilichamen omvatten vele onmisbare laboratoriumtechnieken zoals immunofluorescentie^5,immunoprecipitatie⁶, stroomcytometrie^7,ELISA en westerse blotting. Voor elk van deze toepassingen is het verkrijgen van nauwkeurige metingen van de bindende eigenschappen van het antilichaam, inclusief bindende affiniteit en specificiteit, van cruciaal belang.

Sinds de introductie van het eerste commerciële oppervlakteplasmon resonantie (SPR) instrument in 1990 zijn optische biosensoren de “gouden standaard” van antilichaamkarakterisering geworden, maar andere technieken, waaronder ELISA, worden ook routinematig gebruikt om antilichaamaffinities^8,9te meten . Deze methoden vereisen meestal immobilisatie of etikettering van de geanalyseerde moleculen, die mogelijk van invloed kunnen zijn op de interactie van belang. Ze zijn ook relatief traag, waarbij meerdere teststappen voordat de resultaten kunnen worden verzameld voor gegevensanalyse. Een onlangs ontwikkelde single-molecule methode, massa fotometrie (MP), detecteert moleculen direct in oplossing wanneer ze landen op het oppervlak van de microscoop coverslip^10,11. De op lichtverstrooiing gebaseerde optische detectie die MP gebruikt, vereist geen eiwitlabeling of modificatie. Individuele eiwitmoleculen worden geregistreerd door de interferometrische verstrooiingsmicroscoop als donkere vlekken die in de afbeelding verschijnen(figuur 1D), en enkele duizenden moleculen kunnen worden gedetecteerd tijdens de data-acquisitie van één minuut¹². Het signaal dat door elk afzonderlijk deeltje wordt gegenereerd, wordt gekwantificeerd en de contrastwaarde (relatieve duisternis) wordt berekend. De interferometrische contrastwaarden zijn evenredig aan de moleculaire massa’s van de eiwitten, waardoor gebonden en vrije soorten in het antigeen-antilichaammengsel kunnen worden geïdentificeerd. Tegelijkertijd meet MP door moleculaire landingsgebeurtenissen te tellen rechtstreeks de soortenpopulaties. Dit geeft MP gebaseerde methoden een unieke mogelijkheid om onafhankelijk te kwantificeren affiniteiten van meerdere bindende sites.

Binding van de antigeen (Ag)moleculen aan de twee bindende plaatsen van het intacte antilichaam (Ab) kan worden omschreven als:

met de evenwichtsassociatie constanten K_a1 en K_a2 gedefinieerd als:

waar c_i en f_i respectievelijk concentratie en fractie van het onderdeel ivertegenwoordigen. De totale antigeenconcentratie (c_Ag)_tot kan worden uitgedrukt als:

Aangezien de totale concentraties van het antilichaam (c_Ab)_tot en antigeen (c_Ag)_tot bekend zijn, kan deze vergelijking worden gebruikt om rechtstreeks te passen bij de experimentele componentfracties verkregen uit de MP-metingen en de evenwichtsstifies K_a1 en K_a2 te berekenen (zie Aanvullende informatie).

De MP-gegevens kunnen ook worden gebruikt om de samenwerking tussen de twee antilichaambindende sites¹¹te schatten . Voor twee antilichaamparatopes met identieke microscopische bindende constanten, de statistische factoren die het proces van bevolking van Abbeschrijven · Ag en Ab· Ag₂ complexen dicteren dat de schijnbare macroscopische evenwichtsconstanten K_a1 en K_a2 zal niet numeriek gelijk zijn, en K_a1 = 4K_a2. Daarom wijzen de experimentele waarden van K_a1 < 4K_a2 op een positieve samenwerking tussen de twee antilichaambindingslocaties. K _a1 > 4K_a2 geeft ook negatieve samenwerking aan.

MP-metingen van de antigeen-antilichaambinding zijn snel en vereisen een kleine hoeveelheid materiaal. De MP-massaverdelingen die worden gebruikt voor evenwichtsconstante berekeningen bieden aanvullende informatie over de eigenschappen van het monster en maken de beoordeling van de monsterzuiverheid, oligomerisatie en aggregatie in één experiment mogelijk. Dezelfde methode kan worden gebruikt om hoge affiniteit eiwit-eiwit binding te meten, en MP is vooral nuttig voor studies van multi-valent eiwit interacties. Multi-eiwit complexen hebben meestal grote moleculaire massa’s, optimaal voor MP detectie, en single-molecule gegevens kunnen worden gebruikt om stoichiometrie te meten en affinities van meerdere bindende sites tegelijk te berekenen. Deze informatie is meestal moeilijk te verkrijgen met behulp van bulk-gebaseerde methoden.

Zonder wijzigingen is het huidige protocol geschikt voor metingen van relatief hoge affiniteit, submicromolar interacties met antigenen van een moleculaire massa van 20 kDa of groter. Voor optimale resultaten moeten eiwitvoorraden van hoge zuiverheid zijn, maar er zijn geen specifieke buffervereisten. Door mp te gebruiken, kan de antigeen-antilichaambinding in minder dan vijf minuten worden beoordeeld. Het verzamelen en analyseren van gegevens die nodig zijn voor nauwkeurige K_{d-berekeningen} kan binnen 30 minuten worden uitgevoerd.