Быстрое определение антител-антигена Аффинити по массовой фотометрии

Антитела стали повсеместными инструментами молекулярной биологии и широко используются как в медицинских, так и в научно-исследовательских приложениях. В медицине, они имеют решающее значение в диагностике, но их терапевтическое применение также расширяется и новые антитела на основе^{терапии постоянно разрабатываются 1,2,3,4}. Научное применение антител включает в себя множество незаменимых лабораторных методов, таких как иммунофлуоресценция^{5,иммунопреципиентация 6,цитометрия потока 7,}ELISA и западное blotting. Для каждого из этих применений, получение точных измерений связывающих свойств антитела, включая связывающее сродство и специфичность, имеет решающее значение.

С тех пор как в 1990 году был введен первый коммерческий прибор для производства поверхностных плазмоновых резонансов (SPR), оптические биосенсоры стали «золотым стандартом» характеристики антител, но другие методы, включая ELISA, также регулярно используются для^{измерения сродства антител 8,9.} Эти методы обычно требуют иммобилизации или маркировки анализируемых молекул, что потенциально может повлиять на взаимодействие интересов. Они также относительно медленные, включающие несколько этапов анализа, прежде чем результаты могут быть собраны для анализа данных. Недавно разработанный одномекулярный метод, массовая фотометрия (MP), обнаруживает молекулы непосредственно в растворе, когда они приземляются на поверхность микроскопа coverslip^10,11. Световое рассеяние на основе оптического обнаружения, которое использует MP, не требует маркировки или модификации белка. Индивидуальные молекулы белка регистрируются интерферометрическим рассеянным микроскопом как темные пятна, появляющиесяна изображении (рисунок 1D),и несколько тысяч молекул могут быть обнаружены в течение одной минуты получения^{данных 12}. Сигнал, генерируемый каждой отдельной частицей, измеряется количественно, и рассчитывается его контрастное значение (относительная темнота). Значения интерферометрического контраста пропорциональны молекулярным массам белков, что позволяет идентифицировать связанные и свободные виды в смеси антиген-антител. В то же время, подсчитывая молекулярные посадочные явления, депутат напрямую измеряет популяции видов. Это дает методам, основанным на MP, уникальную возможность независимой количественной оценки сродства нескольких связывающих сайтов.

Связывание молекул антигена(Ag) с двумя связывающими участками нетронутого антитела(Ab) может быть описано как:

с константами равновесной ассоциации K_a1 и K_{a2, определяемыми} как:

где c_i и f_я представляю концентрацию и фракцию компонента i,соответственно. Общая концентрация антигена (c_Ag)_{tot может} быть выражена как:

Так как общие концентрации антитела (cAb )_totи антигена (c_Ag)_tot известны, это уравнение может быть использовано непосредственно для непосредственного времени подходят экспериментальные компонентные фракции, полученные из измерений MP и вычислить константы равновесной ассоциации K_{a1 и} K_a2 (см. Дополнительную информацию).

Данные MP также могут быть использованы для оценки кооператорности между двумя сайтами связывания антител^11. Для двух паратопов антител с идентичными микроскопическими связывающими константами, статистические факторы, описывающие процесс популяции Аб Аг и Аб Ag₂ комплексы диктуют, что очевидное макроскопическое равновесие константы K_a1 и K_a2 не будет численно равным, и K a1 и 4K_a2. Таким образом, экспериментальные значения K_{a1 lt;} 4K_a2 указывают на положительную кооператорность между двумя сайтами связывания антител. Аналогичным образом, K_a1 и 4K_{a2 указывает} на отрицательную кооператорность.

Измерения MP антиген-антитела связывая сродства быстры и требуют малого количества материала. Массовые распределения MP, используемые для равновесных постоянных расчетов, предоставляют дополнительную информацию о свойствах выборки и позволяют оценить чистоту выборки, олигомеризацию и агрегацию в одном эксперименте. Тот же метод может быть использован для измерения высокой сродства белково-белковой привязки, и MP особенно полезен для исследований многовалентных белковых взаимодействий. Мульти-белковые комплексы обычно имеют большие молекулярные массы, оптимальные для обнаружения MP, и одномекулярные данные могут быть использованы для измерения стоихиометрии и расчета сродства нескольких связывающих участков одновременно. Эта информация, как правило, трудно получить с помощью навалочных методов.

Без изменений текущий протокол подходит для измерений относительно высокого сродства, субмимолярных взаимодействий с антигенами молекулярной массы 20 кДа и больше. Для достижения оптимальных результатов запасы белка должны быть высокой чистоты, но особых требований к буферу не существует. С помощью MP, связывание антиген-антител может быть оценено менее чем за пять минут. Сбор и анализ данных, необходимых для точных расчетов K_d, может быть выполнен в течение 30 минут.