נחישות מהירה של זיקה נוגדנים אנטיגן על ידי פוטומטריה המונית

נוגדנים הפכו לכלים בכל מקום של ביולוגיה מולקולרית והם משמשים בהרחבה הן ביישומים רפואיים והן ביישומים מחקריים. ברפואה, הם חשובים ביותר באבחון, אבל היישומים הטיפוליים שלהם מתרחבים גם טיפולים מבוססי נוגדנים חדשים^{מפותחים כל הזמן 1,2,3,4}. היישומים המדעיים של נוגדנים כוללים טכניקות מעבדה חיוניות רבות כגון immunofluorescence⁵, immunoprecipitation⁶, ציטומטריה^{זרימה 7}, ELISA, ו סופג מערבי. עבור כל אחד מיישומים אלה, השגת מדידות מדויקות של תכונות מחייבות של הנוגדן, כולל זיקה מחייבת וספניות, היא בעלת חשיבות מכרעת.

מאז הוצג המכשיר המסחרי הראשון תהודה פלסמון (SPR) בשנת 1990, biosensors אופטי הפכו “תקן הזהב” של אפיון נוגדנים, אבל טכניקות אחרות, כולל ELISA, משמשים גם באופן שגרתי למדידת זיקה^{נוגדנים 8,9}. שיטות אלה דורשות בדרך כלל קיבוע או תיוג של המולקולות המנותחות, אשר עלולות להשפיע על האינטראקציה של עניין. הם גם איטיים יחסית, מעורבים שלבי בדיקה מרובים לפני שניתן יהיה לאסוף את התוצאות לניתוח נתונים. שיטה שפותחה לאחרונה מולקולה אחת, פוטומטריה המונית (MP), מזהה מולקולות ישירות בת פתרון כאשר הם נוחתים על פני השטח של המיקרוסקופ מכסה את^{הנקודה 10,11}. הזיהוי האופטי מבוסס פיזור האור שחבר הפרלמנט משתמש בו אינו דורש תיוג או שינוי של חלבונים. מולקולות חלבון בודדות מתועדות על ידי מיקרוסקופ פיזור אינטרפרומטריכתמים כהיםהמופיעים בתמונה ( איור 1D ), וכמה אלפי מולקולות ניתן לזהות במהלך רכישת נתונים של^{דקה אחת 12}. האות שנוצר על-ידי כל חלקיק בודד מכומת, וערך החדות שלו (חשכה יחסית) מחושב. ערכי הניגוד האינטרפרומטרי פרופורציונליים להמונים המולקולריים של החלבונים, המאפשרים זיהוי של מינים קשורים וחופשיים בתערובת נוגדני האנטיגן. במקביל, על ידי ספירת אירועי נחיתה מולקולרית, חבר הפרלמנט מודד ישירות את אוכלוסיות המינים. הדבר מעניק לשיטות מבוססות MP יכולת ייחודית לכמת באופן עצמאי זיקה לאתרי איגוד מרובים.

קשירה של מולקולותאנטיגן( Ag ) לשני אתרי קשירה של הנוגדןשלם( Ab ) ניתן לתאר כ:

עם קבועי שיוך שיווי המשקל K a1_ו- K_{a2 המוגדרים} כ:

כאשר c_{i ו-} f אני מייצג ריכוז ושבר של הרכיב i, בהתאמה. ריכוז אנטיגן הכולל (c_Ag)_{טוט יכול} לבוא לידי ביטוי כ:

מאז הריכוזים הכוללים שלהנוגדן( c_Ab)_טוט ואנטיגן (c_Ag)_טוט ידועים, משוואה זו יכולה לשמש כדי להתאים ישירות את שברי הרכיב הניסיוני המתקבלים ממדידות MP ולחשב את קבועי שיוך שיווי המשקל K A1 ו- K_a2 (ראה מידע משלים).

ניתן להשתמש גם בנתונים של MP כדי להעריך שיתוף פעולה בין שני אתרי איגוד הנוגדנים¹¹. עבור שני משטחי נוגדנים עם קבועי קשירה מיקרוסקופיים זהים, הגורמים הסטטיסטיים המתארים את תהליך האוכלוסייה של Ab· אג ואב· קומפלקסים Ag₂ מכתיבים כי קבועי שיווי המשקל המקרוסקופיים לכאורה K_a1 ו- K_a2 לא יהיו שווים מבחינה מספרית, ו- K_a1 = 4K_a2. לכן, הערכים הניסיוניים של K_a1 < 4K_{a2 מצביעים על} שיתוף פעולה חיובי בין שני אתרי איגוד הנוגדנים. באופן דומה, K_a1 > 4K a2_מציין שיתוף פעולה שלילי.

מדידות MP של זיקה מחייב נוגדן אנטיגן הם מהירים ודורשים כמות קטנה של חומר. ההתפלגויות ההמוניות של MP המשמשות לחישובים קבועים של שיווי משקל מספקות מידע נוסף אודות מאפייני המדגם ומאפשרות הערכה של טוהר המדגם, אוליגומריזציה וצבירה בניסוי יחיד. ניתן להשתמש באותה שיטה כדי למדוד זיקה גבוהה חלבון חלבון מחייב, ו MP הוא שימושי במיוחד עבור מחקרים של אינטראקציות חלבון רב ואלנט. קומפלקסים מרובי חלבונים בדרך כלל יש מסות מולקולריות גדולות, אופטימלי לגילוי MP, ונתונים מולקולה אחת ניתן להשתמש כדי למדוד stoichiometry ולחשב זיקה של אתרי קשירה מרובים בו זמנית. בדרך כלל קשה להשיג מידע זה בשיטות המבוססות בצובר.

ללא שינויים, הפרוטוקול הנוכחי מתאים למדידות של זיקה גבוהה יחסית, אינטראקציות תת מיקרומולריות עם אנטיגנים של מסה מולקולרית של 20 kDa ומעלה. לקבלת תוצאות מיטביות, מלאי החלבון צריך להיות בעל טוהר גבוה, אך אין דרישות חיץ ספציפיות. באמצעות MP, ניתן להעריך את איגוד נוגדני האנטיגן בפחות מחמש דקות. איסוף הנתונים והניתוח הנדרשים לחישובי K_D מדויקים יכולים להתבצע תוך 30 דקות.