Determinação rápida da afinidade anticorpo-antígeno por fotometria em massa

Os anticorpos tornaram-se ferramentas onipresentes da biologia molecular e são usados extensivamente em aplicações médicas e de pesquisa. Na medicina, eles são criticamente importantes em diagnósticos, mas suas aplicações terapêuticas também estão se expandindo e novas terapias baseadas em anticorpos estão sendo constantemente desenvolvidas^1,2,3,4. As aplicações científicas dos anticorpos incluem muitas técnicas laboratoriais indispensáveis, como a imunofluorescência^5,a imunoprecipitação^6,a citometria de fluxo^7,a ELISA e a mancha ocidental. Para cada uma dessas aplicações, obter medidas precisas das propriedades vinculantes do anticorpo, incluindo afinidade e especificidade vinculantes, é de importância crucial.

Desde que o primeiro instrumento de ressonância de plasmon de superfície comercial (SPR) foi introduzido em 1990, os biosensores ópticos tornaram-se o “padrão ouro” da caracterização de anticorpos, mas outras técnicas, incluindo a ELISA, também são rotineiramente utilizadas para medir afinidades de anticorpos^8,9. Esses métodos geralmente requerem imobilização ou rotulagem das moléculas analisadas, o que pode afetar potencialmente a interação de interesse. Eles também são relativamente lentos, envolvendo múltiplas etapas de ensaio antes que os resultados possam ser coletados para análise de dados. Um método de molécula única recentemente desenvolvido, a fotometria em massa (MP), detecta moléculas diretamente na solução quando pousam na superfície do microscópio, o deslizamento^10,11. A detecção óptica baseada em dispersão de luz que a MP emprega não requer rotulagem ou modificação de proteínas. Moléculas proteicas individuais são registradas pelo microscópio de dispersão interferométrica à medida que manchas escuras aparecem na imagem (Figura 1D), e várias milhares de moléculas podem ser detectadas durante a aquisição de dados de um minuto¹². O sinal gerado por cada partícula individual é quantificado, e seu valor de contraste (escuridão relativa) é calculado. Os valores de contraste interferométrico são proporcionais às massas moleculares das proteínas, o que permite a identificação de espécies ligadas e livres na mistura antígeno-anticorpo. Ao mesmo tempo, contando eventos de pouso molecular, a MP mede diretamente as populações de espécies. Isso dá aos métodos baseados em MP uma capacidade única de quantificar independentemente as afinidades de vários sites de vinculação.

A ligação das moléculas de antígeno(Ag)aos dois locais de ligação do anticorpo intacto(Ab)pode ser descrita como:

com as constantes de associação de equilíbrio K_a1 e K_a2 definidas como:

onde c_i e f _i representam concentração e fração do componente i,respectivamente. A concentração total de antígeno(c_Ag)_pode ser expressa como:

Uma vez que são conhecidas as concentrações totais do anticorpo (c_Ab)_tot e antígeno(c_Ag),esta equação pode ser usada para se encaixar diretamente nas frações de componentes experimentais obtidas das medições de MP e calcular as constantes de associação de equilíbrio K_a1 e K_a2 (ver Informações Complementares).

Os dados da MP também podem ser usados para estimar a cooperatividade entre os dois locais de ligação de anticorpos¹¹. Para dois paratopos de anticorpos com constantes microscópicas idênticas, os fatores estatísticos que descrevem o processo populacional do Ab· Ag e Ab· Oscomplexos Ag₂ ditam que as aparentes constantes de equilíbrio macroscópico K_a1 e K_a2 não serão numericamente iguais, e K_a1 = 4K_a2. Portanto, os valores experimentais de K_a1 < 4K_a2 indicam cooperatividade positiva entre os dois locais de ligação de anticorpos. Da mesma forma, K_a1 > 4K_a2 indica cooperatividade negativa.

As medidas mp da afinidade de ligação antígeno-anticorpo são rápidas e requerem uma pequena quantidade de material. As distribuições de massa mp utilizadas para cálculos constantes de equilíbrio fornecem informações adicionais sobre as propriedades da amostra e permitem a avaliação da pureza da amostra, oligomerização e agregação em um único experimento. O mesmo método pode ser usado para medir a ligação proteína-proteína de alta afinidade, e a MP é particularmente útil para estudos de interações proteicas multi-valentes. Complexos multi-proteínas geralmente têm grandes massas moleculares, ótimas para detecção de MP, e dados de molécula única podem ser usados para medir a estequiometria e calcular afinidades de múltiplos locais de ligação simultaneamente. Essas informações geralmente são difíceis de obter usando métodos baseados em massa.

Sem modificações, o protocolo atual é adequado para medições de interações submicrlares relativamente altas e submicrílares com antígenos de uma massa molecular de 20 kDa ou maior. Para obter resultados ótimos, os estoques de proteínas devem ser de alta pureza, mas não há requisitos específicos de buffer. Usando MP, a ligação antígeno-anticorpo pode ser avaliada em menos de cinco minutos. A coleta e análise de dados necessárias para cálculos K_d precisos podem ser realizadas dentro de 30 minutos.