Rapida determinazione dell'affinità anticorpo-antigene mediante fotometria di massa

Gli anticorpi sono diventati strumenti onnipresenti della biologia molecolare e sono ampiamente utilizzati sia in applicazioni mediche che di ricerca. In medicina, sono di fondamentale importanza nella diagnostica, ma anche le loro applicazioni terapeutiche si stanno espandendo e nuove terapie basate su anticorpi vengono costantemente^{sviluppate 1,2,3,4}. Le applicazioni scientifiche degli anticorpi includono molte tecniche di laboratorio indispensabili come l’immunofluorescenza^5,l’immunoprecipitazione^6,la citometria a^{flusso 7,}ELISA e l’blotting occidentale. Per ognuna di queste applicazioni, ottenere misurazioni accurate delle proprietà di legame dell’anticorpo, inclusa l’affinità di legame e la specificità, è di fondamentale importanza.

Da quando il primo strumento commerciale di risonanza plasmonica di superficie (SPR) è stato introdotto nel 1990, i biosensori ottici sono diventati il “gold standard” della caratterizzazione degli anticorpi, ma altre tecniche, tra cui ELISA, sono anche abitualmente utilizzate per misurare le affinità^{anticorpali 8,9}. Questi metodi di solito richiedono l’immobilizzazione o l’etichettatura delle molecole analizzate, che possono potenzialmente influenzare l’interazione di interesse. Sono anche relativamente lenti, coinvolgendo più fasi di dosaggio prima che i risultati possano essere raccolti per l’analisi dei dati. Un metodo a singola molecola recentemente sviluppato, la fotometria di massa (MP), rileva le molecole direttamente in soluzione quando atterrano sulla superficie del microscopio coverslip^10,11. Il rilevamento ottico basato sulla diffusione della luce che MP utilizza non richiede l’etichettatura o la modifica delle proteine. Le singole molecole proteiche sono registrate dal microscopio a dispersione interferometrica come macchie scure che appaiono nell’immagine (Figura 1D), e diverse migliaia di molecole possono essere rilevate durante l’acquisizione di dati di un minuto¹². Il segnale generato da ogni singola particella viene quantificato e viene calcolato il suo valore di contrasto (oscurità relativa). I valori di contrasto interferometrico sono proporzionali alle masse molecolari delle proteine, il che consente l’identificazione di specie legate e libere nella miscela antigene-anticorpo. Allo stesso tempo, contando gli eventi di atterraggio molecolare, MP misura direttamente le popolazioni di specie. Ciò offre ai metodi basati su MP una capacità unica di quantificare in modo indipendente le affinità di più siti di associazione.

Il legame delle molecole diantigene( Ag ) ai due siti di legame dell’anticorpo intatto (Ab) può essere descritto come:

con le costanti di associazione di equilibrio K_a1 e K_a2 definite come:

dove c_i e f_i rappresentano rispettivamente la concentrazione e la frazione del componente i. La concentrazione totale di antigeni (c_Ag)_può essere espressa come:

Poiché le concentrazioni totali_{dell’anticorpo} (c_Ab) tot e dell’antigene (c_Ag)_tot sono note, questa equazione può essere utilizzata per adattarsi direttamente alle frazioni di componenti sperimentali ottenute dalle misurazioni MP e calcolare le costanti di associazione di equilibrio K_a1 e K_a2 (vedi Informazioni supplementari).

I dati MP possono anche essere utilizzati per stimare la cooperatività tra i due siti di legame anticorpale¹¹. Per due paratopi anticorpali con identiche costanti di legame microscopico, i fattori statistici che descrivono il processo di popolazione dell’Ab· Ag e Ab· I_{complessi ag 2} impongono che le costanti apparenti di equilibrio macroscopico K_a1 e K_a2 non siano numericamente uguali, e K_a1 = 4K_a2. Pertanto, i valori sperimentali di K_a1 < 4K_a2 indicano una cooperatività positiva tra i due siti di legame anticorpale. Allo stesso modo, K_a1 > 4K_a2 indica una cooperatività negativa.

Le misurazioni MP dell’affinità legante antigene-anticorpo sono veloci e richiedono una piccola quantità di materiale. Le distribuzioni di massa MP utilizzate per i calcoli costanti di equilibrio forniscono informazioni aggiuntive sulle proprietà del campione e consentono la valutazione della purezza del campione, dell’oligomerizzazione e dell’aggregazione in un singolo esperimento. Lo stesso metodo può essere usato per misurare il legame proteina-proteina ad alta affinità, e mp è particolarmente utile per studi sulle interazioni proteiche multivalenti. I complessi multi-proteina di solito hanno grandi masse molecolari, ottimali per il rilevamento mp, e i dati a singola molecola possono essere usati per misurare la stechiometria e calcolare contemporaneamente affinità di più siti di legame. Queste informazioni sono in genere difficili da ottenere utilizzando metodi basati sulla massa.

Senza modifiche, l’attuale protocollo è adatto per misurazioni di interazioni sub-micromolare ad affinità relativamente elevata con antigeni di massa molecolare di 20 kDa o superiore. Per risultati ottimali, gli stock proteici dovrebbero essere di elevata purezza, ma non ci sono requisiti tampone specifici. Utilizzando MP, il legame antigene-anticorpo può essere valutato in meno di cinque minuti. La raccolta e l’analisi dei dati necessarie per calcoli K_d accurati possono essere eseguite entro 30 minuti.