Geração de neurônios humanos e oligodendrócitos a partir de células-tronco pluripotentes para modelagem de interações neurônio-oligodendrócitos

As células da linhagem de oligodendrócitos – incluindo células precursoras de oligodendrócitos (OPCs), oligodendrócitos mielinizantes e tipos de transição entre eles – constituem um grupo importante de células cerebrais humanas¹ que participam ativamente de muitas funções críticas para o bom funcionamento e manutenção do nosso sistema nervoso central ao longo do desenvolvimento neural e envelhecimento 2,3,4 . Enquanto os oligodendrócitos são bem conhecidos por produzir mielina para facilitar a transmissão da atividade neuronal e apoiar a saúde axonal na substância branca, as OPCs são abundantes (~5%) na massa cinzenta, onde a mielinização é escassa e desempenham funções de sinalização dependentes da atividade para governar o comportamento de aprendizagem e a formação da memória 5,6,7,8 . Como as células oligodendrogliais funcionam e a disfunção na patogênese da doença de Alzheimer (DA) e outras condições neurodegenerativas associadas à idade têm sido pouco estudadas⁹. As inadequações de um sistema modelo adequado e as deficiências nos conhecimentos gerais para orientar um caminho experimental a seguir são as principais razões para essa lacuna.

À luz dos mais recentes avanços na derivação de células cerebrais humanas a partir de células-tronco pluripotentes, incluindo células-tronco embrionárias (ES) e células-tronco pluripotentes induzidas (iPS), tais modelos celulares em conjunto com ferramentas modernas de edição de genes surgiram como ferramentas robustas para lidar com o intrincado nexo de interações celulares no cérebro e são capazes de demonstrar manifestações de doenças específicas de humanos^{10, 11}. Considerando que os tipos individuais de células cerebrais podem exibir efeitos distintos e até conflitantes diante das mesmas condições promotoras de DA^12,13, essa metodologia de células-tronco oferece exclusivamente informações específicas do tipo de célula que anteriormente foram perdidas usando modelos estabelecidos in vivo ou in vitro que fornecem apenas leituras agregadas de coleções de tipos de células cerebrais. Na última década, um bom número de protocolos confiáveis tem sido desenvolvido para gerar neurônios humanos a partir da transdiferenciação de células ES/iPS ou conversão direta de outros tipos celulares terminalmente diferenciados (por exemplo, fibroblastos)^14,15. Em particular, a aplicação de fatores-chave de transcrição neurogênica (por exemplo, neurogenina 2, Ngn2)¹⁶ a células-tronco pluripotentes humanas pode gerar uma população homogênea de tipos de células neuronais bem caracterizadas para culturas puras sem a necessidade de cocultura com células gliais^12,17,18. Para oligodendrócitos humanos induzidos, existem alguns protocolos publicados que podem gerar células funcionais altamente semelhantes às suas contrapartes primárias, com uma ampla gama de eficiência e demanda em tempo e recursos 19,20,21,22,23,24,25,26,27,28 . Até o momento, nenhum desses protocolos foi aplicado para investigar como as células oligodendrogliais respondem e afetam a patogênese da DA.

Aqui, descrevemos nossos protocolos aprimorados para culturas únicas e mistas de neurônios induzidos por humanos (iNs) e OPCs/oligodendrócitos (iOPCs/iOLs). O protocolo iN descrito aqui é baseado na abordagem Ngn2 amplamente utilizada¹⁶ e tem a característica adicional de ser livre de glia. Os iNs resultantes são homogêneos e se assemelham muito aos neurônios excitatórios da camada cortical 2/3, com morfologia piramidal, padrão de expressão gênica e características eletrofisiológicas^{características 17,18} (Figura 1). Para superar algumas das barreiras fundamentais na diferenciação dirigida de células-tronco pluripotentes, desenvolvemos um método simples e eficaz de pré-tratamento com baixa dose de dimetilsulfóxido (DMSO)^29,30 e relatamos uma maior propensão das células ES/iPS humanas a se transdiferenciarem em iOPCs e iOLs^31, com base em um protocolo amplamente adaptado de Douvaras e Fossati ³² . Simplificamos ainda mais o protocolo e incorporamos um composto promotor de diferenciação robusto, a clemastina ^7,33,34, para acelerar o processo de maturação oligodendroglial. Como resultado (Figura 2), os iOPCs podem ser gerados em 2 semanas (~95% positivos para o marcador O4) e os iOLs em quatro semanas (expressando marcadores maduros MBP e PLP1). Curiosamente, descobrimos que as iOPCs sozinhas secretam uma quantidade notável de β amiloide (Aβ), consistente com os dados transcriptômicos independentes que mostram a expressão abundante da proteína precursora amiloide (APP) e da protease de processamento β-secretase (BACE1) em células de linhagem de oligodendrócitos^35,36. Além disso, nosso sistema de cocultura iN-iOPC promove o revestimento de axônios por processos iOL positivos para MBP e fornece suporte significativo para a formação de sinapses (Figura 3). Assim, os protocolos que detalhamos abaixo têm vantagens técnicas e biológicas sobre os métodos de co-cultura neurônio-oligodendroglia previamente catalogados e são promissores na melhor modelagem da neurodegeneração na DA.