Generierung humaner Neuronen und Oligodendrozyten aus pluripotenten Stammzellen zur Modellierung von Neuron-Oligodendrozyten-Interaktionen

Oligodendrozyten-Linienzellen – einschließlich Oligodendrozyten-Vorläuferzellen (OPCs), myelinisierende Oligodendrozyten und Übergangstypen dazwischen – bilden eine Hauptgruppe menschlicher Gehirnzellen¹, die aktiv an vielen kritischen Funktionen für den ordnungsgemäßen Betrieb und die Aufrechterhaltung unseres zentralen Nervensystems während der neuronalen Entwicklung und des Alterns beteiligt^sind 2,3,4 . Während Oligodendrozyten dafür bekannt sind, Myelin zu produzieren, um die Übertragung neuronaler Aktivität zu erleichtern und die axonale Gesundheit in der weißen Substanz zu unterstützen, sind OPCs reichlich vorhanden (~ 5%) in der grauen Substanz, wo Myelinisierung knapp ist und aktivitätsabhängige Signalfunktionen ausführen, um das Lernverhalten und die Gedächtnisbildung zu steuern 5,6,7,8 . Wie oligodendrogliale Zellen funktionieren und dysfunktional in der Pathogenese der Alzheimer-Krankheit (AD) und anderer altersassoziierter neurodegenerativer Erkrankungen ist zu wenig untersucht⁹. Die Unzulänglichkeiten eines geeigneten Modellsystems und Defizite im Allgemeinwissen, um einen experimentellen Weg nach vorne zu leiten, sind die Hauptgründe für diese Lücke.

Angesichts der jüngsten Durchbrüche bei der Gewinnung menschlicher Gehirnzellen aus pluripotenten Stammzellen, einschließlich embryonaler Stammzellen (ES) und induzierter pluripotenter Stammzellen (iPS), haben sich solche zellulären Modelle in Verbindung mit modernen Gen-Editing-Tools als robuste Werkzeuge zur Handhabung des komplizierten Nexus zellulärer Interaktionen im Gehirn erwiesen und sind in der Lage, humanspezifische Krankheitsmanifestationen^{nachzuweisen10. 11}. In Anbetracht der Tatsache, dass einzelne Gehirnzelltypen angesichts der gleichen AD-fördernden Bedingungen unterschiedliche und sogar widersprüchliche Wirkungen zeigen können^12,13, bietet diese Stammzellmethodik auf einzigartige Weise zelltypspezifische Informationen, die zuvor unter Verwendung etablierter In-vivo- oder In-vitro-Modelle^, die nur aggregierte Messwerte aus Sammlungen von Gehirnzelltypen liefern, übersehen wurden. In den letzten zehn Jahren wurde eine große Anzahl zuverlässiger Protokolle entwickelt, um menschliche Neuronen aus Transdifferenzierung von ES/iPS-Zellen oder direkter Umwandlung aus anderen terminaldifferenzierten Zelltypen (z. B. Fibroblasten) zu ^{erzeugen14,15}. Insbesondere die Anwendung wichtiger neurogener Transkriptionsfaktoren (z.B. Neurogenin 2, Ngn2)¹⁶ auf humane pluripotente Stammzellen kann eine homogene Population gut charakterisierter neuronaler Zelltypen für Reinkulturen erzeugen, ohne dass eine Kokulturierung mit Gliazellen erforderlich ist^12,17,18. Für induzierte menschliche Oligodendrozyten gibt es einige veröffentlichte Protokolle, die funktionelle Zellen erzeugen können, die ihren primären Gegenstücken sehr ähnlich sind, mit einer breiten Palette von Effizienz und Bedarf an Zeit und Ressourcen 19,20,21,22,23,24,25,26,27,28 . Bisher wurde keines dieser Protokolle angewendet, um zu untersuchen, wie oligodendrogliale Zellen auf die AD-Pathogenese reagieren und diese beeinflussen.

Hier beschreiben wir unsere verbesserten Protokolle für Einzel- und Mischkulturen von humaninduzierten Neuronen (iNs) und OPCs/Oligodendrozyten (iOPCs/iOLs). Das hier beschriebene iN-Protokoll basiert auf dem weit verbreiteten Ngn2-Ansatz¹⁶ und hat zusätzlich die Eigenschaft, gliafrei zu sein. Die resultierenden iNs sind homogen und ähneln stark den exzitatorischen Neuronen der kortikalen Schicht 2/3 mit charakteristischer pyramidaler Morphologie, Genexpressionsmuster und elektrophysiologischen Merkmalen^17,18 (Abbildung 1). Um einige der grundlegenden Barrieren bei der gerichteten Differenzierung pluripotenter Stammzellen zu überwinden, haben wir eine einfache und effektive Methode der Vorbehandlung von niedrig dosiertem Dimethylsulfoxid (DMSO) entwickelt^29,30 und berichteten über eine erhöhte Neigung menschlicher ES/iPS-Zellen, in iOPCs und iOLs³¹ zu transdifferenzieren^, basierend auf einem weitgehend angepassten Protokoll von Douvaras und Fossati ³² . Wir haben das Protokoll weiter vereinfacht und eine robuste differenzierungsfördernde Verbindung, Clemastin 7,33,34, integriert^, um den Prozess der oligodendroglialen Reifung zu beschleunigen. Als Ergebnis (Abbildung 2) können die iOPCs in 2 Wochen (~95% positiv für den Marker O4) und iOLs in vier Wochen (exprimierend für reife Marker MBP und PLP1) generiert werden. Interessanterweise fanden wir heraus, dass iOPCs allein eine bemerkenswerte Menge an Amyloid-β (Aβ) sezernieren, was mit den unabhängigen transkriptomischen Daten übereinstimmt, die die reichliche Expression des Amyloid-Vorläuferproteins (APP) und der Verarbeitungsprotease β-Sekretase (BACE1) in Oligodendrozyten-Linienzellen^35,36 zeigen. Darüber hinaus fördert unser iN-iOPC-Kokultursystem die Umhüllung von Axonen durch MBP-positive iOL-Prozesse und bietet eine signifikante Unterstützung für die Synapsenbildung (Abbildung 3). Daher haben die Protokolle, die wir unten beschrieben haben, technische und biologische Vorteile gegenüber zuvor katalogisierten Neuron-Oligodendroglia-Co-Kultivierungsmethoden und versprechen eine bessere Modellierung der Neurodegeneration bei AD.