Generazione di neuroni umani e oligodendrociti da cellule staminali pluripotenti per la modellazione delle interazioni neurone-oligodendrociti

Le cellule della linea oligodendrocitaria, comprese le cellule precursori degli oligodendrociti (OPC), gli oligodendrociti mielinizzanti e i tipi di transizione intermedi, costituiscono un gruppo importante di cellule cerebrali umane¹ che partecipano attivamente a molte funzioni critiche per il corretto funzionamento e mantenimento del nostro sistema nervoso centrale durante lo sviluppo neurale e l’invecchiamento ^2,3,4 . Mentre gli oligodendrociti sono ben noti per la produzione di mielina per facilitare la trasmissione dell’attività neuronale e supportare la salute assonale nella sostanza bianca, le OPC sono abbondanti (~ 5%) nella materia grigia dove la mielinizzazione è scarsa e svolgono funzioni di segnalazione dipendenti dall’attività per governare il comportamento di apprendimento e la formazione della memoria 5,6,7,8 . Il modo in cui le cellule oligodendrogliali funzionano e disagiscono nella patogenesi della malattia di Alzheimer (AD) e di altre condizioni neurodegenerative associate all’età è stato poco studiato⁹. Le inadeguatezze di un sistema modello appropriato e le carenze nella conoscenza generale per guidare un percorso sperimentale in avanti sono le ragioni principali di questa lacuna.

Alla luce delle ultime scoperte nel derivare cellule cerebrali umane da cellule staminali pluripotenti, tra cui le cellule staminali embrionali (ES) e le cellule staminali pluripotenti indotte (iPS), tali modelli cellulari in combinazione con moderni strumenti di modifica genetica sono emersi come strumenti robusti per gestire l’intricato nesso delle interazioni cellulari nel cervello e sono in grado di dimostrare manifestazioni di malattia specifiche per l’uomo^{10, 11}. Considerando che i singoli tipi di cellule cerebrali possono mostrare effetti distinti e persino contrastanti di fronte alle stesse condizioni che promuovono l’AD^12,13, questa metodologia di cellule staminali offre in modo univoco informazioni specifiche sul tipo di cellula che in precedenza sono state perse utilizzando modelli stabiliti in vivo o in vitro che forniscono solo letture aggregate da collezioni di tipi di cellule cerebrali. Nell’ultimo decennio, un buon numero di protocolli affidabili sono stati sviluppati per generare neuroni umani dalla trans-differenziazione di cellule ES/iPS o dalla conversione diretta da altri tipi cellulari terminalmente differenziati (ad esempio, fibroblasti)^14,15. In particolare, l’applicazione di fattori chiave di trascrizione neurogenica (ad esempio, neurogenina 2, Ngn2)¹⁶ a cellule staminali pluripotenti umane può generare una popolazione omogenea di tipi di cellule neuronali ben caratterizzati per colture pure senza necessità di cocoltura con cellule gliali^12,17,18. Per gli oligodendrociti umani indotti, ci sono alcuni protocolli pubblicati che possono generare cellule funzionali molto simili alle loro controparti primarie, con una vasta gamma di efficienza e richiesta di tempo e risorse 19,20,21,22,23,24,25,26,27,28 . Ad oggi, nessuno di questi protocolli è stato applicato per studiare come le cellule oligodendrogliali rispondono e influenzano la patogenesi dell’AD.

Qui, descriviamo i nostri protocolli migliorati per colture singole e miste di neuroni indotti umani (iN) e OPC / oligodendrociti (iOPC / iOL). Il protocollo iN qui descritto si basa sull’approccio Ngn2¹⁶ ampiamente utilizzato e ha la caratteristica aggiuntiva di essere privo di glia. Gli iN risultanti sono omogenei e molto simili ai neuroni eccitatori dello strato corticale 2/3, con morfologia piramidale caratteristica, pattern di espressione genica e caratteristiche elettrofisiologiche^17,18 (Figura 1). Per superare alcune delle barriere fondamentali nella differenziazione diretta delle cellule staminali pluripotenti, abbiamo sviluppato un metodo semplice ed efficace di pre-trattamento a basse dosi di dimetilsolfossido (DMSO)^29,30 e riportato una maggiore propensione delle cellule ES / iPS umane a transdifferenziarsi in iOPC e iOLs^31, basato su un protocollo ampiamente adattato da Douvaras e Fossati ³² . Abbiamo ulteriormente semplificato il protocollo e incorporato un robusto composto che promuove la differenziazione, clemastina 7,33,34^, per accelerare il processo di maturazione oligodendrogliale. Di conseguenza (Figura 2), le iOPC possono essere generate in 2 settimane (~95% positivo per il marcatore O4) e iOL in quattro settimane (esprimendo marcatori maturi MBP e PLP1). È interessante notare che abbiamo scoperto che le iOPC da sole secernono una notevole quantità di amiloide-β (Aβ), coerente con i dati trascrittomici indipendenti che mostrano l’abbondante espressione della proteina precursore dell’amiloide (APP) e della proteasi di trasformazione β-secretasi (BACE1) nelle cellule del lignaggio oligodendrocitario^35,36. Inoltre, il nostro sistema di co-coltura iN-iOPC promuove l’inguaina degli assoni mediante processi iOL MBP-positivi e fornisce un supporto significativo per la formazione delle sinapsi (Figura 3). Pertanto, i protocolli che abbiamo dettagliato di seguito hanno vantaggi tecnici e biologici rispetto ai metodi di co-coltura neurone-oligodendroglia precedentemente catalogati e promettono di modellare meglio la neurodegenerazione nell’AD.