Nöron-Oligodendrosit Etkileşimlerini Modellemek için Pluripotent Kök Hücrelerden İnsan Nöronlarının ve Oligodendrositlerin Üretilmesi
Summary
Nörodejenerasyonda nöron-glial etkileşimler yetersiz araç ve yöntemler nedeniyle iyi anlaşılamamıştır. Burada, insan pluripotent kök hücrelerinden indüklenmiş nöronlar, oligodendrosit öncü hücreleri ve oligodendrositler elde etmek için optimize edilmiş protokolleri açıklıyoruz ve Alzheimer hastalığında hücre tipine özgü katkıları anlamada bu yöntemlerin değerlerine örnekler sunuyoruz.
Abstract
Alzheimer hastalığı (AD) ve diğer nörodejeneratif bozukluklarda, oligodendroglial başarısızlık yaygın bir erken patolojik özelliktir, ancak özellikle beynin gri maddesinde hastalık gelişimine ve ilerlemesine nasıl katkıda bulunduğu büyük ölçüde bilinmemektedir. Oligodendrosit soy hücrelerinin işlev bozukluğu, miyelinasyondaki eksiklikler ve oligodendrosit öncü hücrelerinin (OPC’ler) bozulmuş kendini yenilemesi ile işaretlenmiştir. Bu iki kusur, en azından kısmen, patolojinin birikmesi boyunca nöron ve oligodendrositler arasındaki etkileşimlerin bozulmasından kaynaklanır. OPC’ler, CNS gelişimi sırasında miyelinizan oligodendrositlere yol açar. Olgun beyin korteksinde, OPC’ler başlıca proliferatif hücrelerdir (toplam beyin hücrelerinin ~% 5’ini oluşturur) ve yeni miyelin oluşumunu nöral aktiviteye bağımlı bir şekilde kontrol eder. Bu tür nöron-oligodendrosit iletişimi, özellikle AD gibi nörodejeneratif koşullar bağlamında, uygun araçların eksikliği nedeniyle önemli ölçüde az çalışılmaktadır. Son yıllarda, grubumuz ve diğerleri, insan pluripotent kök hücrelerinden bireysel olarak fonksiyonel nöronlar ve oligodendrositler üretmek için mevcut protokolleri geliştirmek için önemli ilerlemeler kaydetmiştir. Bu yazıda, nöron-oligodendrosit bağlantılarını modellemek için bir ko-kültür sisteminin kurulması da dahil olmak üzere optimize edilmiş prosedürlerimizi açıklamaktayız. Açıklayıcı sonuçlarımız, OPC’lerin / oligodendrositlerin beyin amiloidozuna ve sinaps bütünlüğüne beklenmedik bir katkısını önermektedir ve bu metodolojinin AD araştırması için faydasını vurgulamaktadır. Bu indirgemeci yaklaşım, spesifik hetero-hücresel etkileşimleri beynin içindeki doğal karmaşıklıktan ayırmak için güçlü bir araçtır. Burada tanımladığımız protokollerin, nörodejenerasyonun patogenezinde oligodendroglial defektler üzerine gelecekteki çalışmaları kolaylaştırması beklenmektedir.
Introduction
Oligodendrosit soy hücreleri – oligodendrosit öncü hücreleri (OPC’ler), miyelinizan oligodendrositler ve aralarındaki geçiş tipleri dahil – nöral gelişim ve yaşlanma boyunca merkezi sinir sistemimizin düzgün çalışması ve bakımı için birçok kritik fonksiyona aktif olarak katılan önemli bir insan beyin hücresi grubunu oluşturur1 2,3,4 . Oligodendrositler, nöronal aktivite iletimini kolaylaştırmak ve beyaz cevherde aksonal sağlığı desteklemek için miyelin üretmesiyle iyi bilinirken, OPC’ler, miyelinasyonun az olduğu gri maddede bol miktarda (~% 5) bulunur ve öğrenme davranışını ve hafıza oluşumunu yönetmek için aktiviteye bağlı sinyal işlevlerini yerine getirir 5,6,7,8 . Alzheimer hastalığı (AD) ve diğer yaşa bağlı nörodejeneratif durumların patogenezinde oligodendroglial hücrelerin nasıl işlev gördüğü ve işlev bozukluğu az çalışılmıştır9. Uygun bir model sistemin yetersizlikleri ve deneysel bir yolu ileriye götürecek genel bilgi eksiklikleri bu boşluğun başlıca nedenleridir.
İnsan beyin hücrelerinin, embriyonik kök (ES) ve indüklenmiş pluripotent kök (iPS) hücreler de dahil olmak üzere pluripotent kök hücrelerden türetilmesindeki en son atılımların ışığında, modern gen düzenleme araçlarıyla birlikte bu tür hücresel modeller, beyindeki hücresel etkileşimlerin karmaşık bağlantı noktasını ele almak için sağlam araçlar olarak ortaya çıkmıştır ve insana özgü hastalık belirtilerini gösterebilmektedir10, 11. Bireysel beyin hücresi tiplerinin, aynı AD’yi teşvik eden koşullar12,13 karşısında farklı ve hatta çelişkili etkiler gösterebileceği göz önüne alındığında, bu kök hücre metodolojisi, daha önce beyin hücresi tiplerinin koleksiyonlarından yalnızca toplu okumalar sağlayan in vivo veya in vitro modeller kullanılarak gözden kaçırılmış olan hücre tipine özgü bilgileri benzersiz bir şekilde sunar. Son on yılda, ES / iPS hücrelerinin trans-farklılaşmasından veya diğer ölümcül olarak farklılaşmış hücre tiplerinden (örneğin, fibroblastlar) doğrudan dönüşümden insan nöronları üretmek için çok sayıda güvenilir protokol geliştirilmiştir 14,15. Özellikle, anahtar nörojenik transkripsiyon faktörlerinin (örneğin, nörogenin 2, Ngn2)16’nın insan pluripotent kök hücrelerine uygulanması, glial hücrelerle pıhtılaşmaya gerek kalmadan saf kültürler için iyi karakterize edilmiş nöronal hücre tiplerinin homojen bir popülasyonunu oluşturabilir12,17,18. İndüklenmiş insan oligodendrositleri için, birincil meslektaşlarına çok benzeyen fonksiyonel hücreler üretebilen, zaman ve kaynaklarda geniş bir verimlilik ve talep yelpazesine sahip birkaç yayınlanmış protokol vardır 19,20,21,22,23,24,25,26,27,28 . Bugüne kadar, oligodendroglial hücrelerin AD patogenezine nasıl tepki verdiğini ve onu nasıl etkilediğini araştırmak için bu protokollerin hiçbiri uygulanmamıştır.
Burada, insan kaynaklı nöronların (iN’ler) ve OPC’lerin / oligodendrositlerin (iOPC’ler / iOL’ler) tek ve karışık kültürleri için geliştirilmiş protokollerimizi açıklıyoruz. Burada açıklanan iN protokolü, yaygın olarak kullanılan Ngn2 yaklaşımı16’ya dayanmaktadır ve glia-free olma özelliğine sahiptir. Ortaya çıkan iN’ler homojendir ve karakteristik piramidal morfoloji, gen ekspresyon paterni ve elektrofizyolojik özellikler17,18 ile kortikal tabaka 2/3 uyarıcı nöronlara oldukça benzemektedir (Şekil 1). Pluripotent kök hücrelerin yönlendirilmiş farklılaşmasındaki bazı temel engellerin üstesinden gelmek için, düşük doz dimetil sülfoksit (DMSO) ön tedavisi29,30 için basit ve etkili bir yöntem geliştirdik ve Douvaras ve Fossati32 tarafından geniş çapta uyarlanmış bir protokole dayanarak, insan ES / iPS hücrelerinin iOPC’lere ve iOL’lere31’e dönüşme eğiliminin arttığını bildirdik. . Protokolü daha da basitleştirdik ve oligodendroglial olgunlaşma sürecini hızlandırmak için sağlam bir farklılaşmayı teşvik eden bileşik olan clemastine 7,33,34’ü dahil ettik. Sonuç olarak (Şekil 2), iOPC’ler 2 hafta içinde (O4 belirteci için ~% 95 pozitif) ve iOL’ler dört hafta içinde (olgun belirteçler MBP ve PLP1’i ifade eder) üretilebilir. İlginç bir şekilde, iOPC’lerin tek başına kayda değer miktarda amiloid-β (Aβ) salgıladığını, amiloid öncü proteininin (APP) bol miktarda ekspresyonunu ve oligodendrositsoy hücrelerinde proteaz β-sekretazın (BACE1) işlendiğini gösteren bağımsız transkriptomik verilerle tutarlı olduğunu bulduk. Ayrıca, iN-iOPC ko-kültür sistemimiz, aksonların MBP-pozitif iOL süreçleri ile kaplanmasını teşvik eder ve sinaps oluşumu için önemli destek sağlar (Şekil 3). Bu nedenle, aşağıda detaylandırdığımız protokoller, daha önce kataloglanmış nöron-oligodendroglia ortak kültürleme yöntemlerine göre teknik ve biyolojik avantajlara sahiptir ve AD’de nörodejenerasyonun daha iyi modellenmesinde bir umut vaat etmektedir.
Protocol
Representative Results
Discussion
Sinaps yapılarını stabilize etmek ve miyelinasyon yoluyla tuzlayıcı sinyal iletimini kolaylaştırmak için fiziksel ve metabolik desteğe ek olarak, oligodendrosit soy hücreleri, nöronlarla hızlı ve dinamik çapraz görüşmeler yoluyla nöronal aktivite paternini şekillendirebilir 5,6,7. AD patolojisinde oligodendroglial yanıtlar başlangıçta inflamasyon ve oksidatif streslere ikincil olarak kabul edilirken, şimd…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Bu çalışma, Ulusal Sağlık Enstitüleri (R00 AG054616’dan Y.A.H.’ye ve T32 GM136566’dan K.C.’ye), Stanford Üniversitesi Tıp Fakültesi ve Siebel Bursu’ndan (S.C.’ye verildi) gelen hibelerle desteklenmiştir. Y.A.H., Brown Translasyonel Bilimler Enstitüsü’ndeki Translasyonel Sinirbilim Merkezi’nden GFL Translasyonel Profesörüdür.
Materials
| Accutase | STEMCELL Technologies | 7920 | |
| B27 supplement | ThermoFisher | 17504044 | |
| bFGF | ThermoFisher | PHG 0266 | |
| cAMP | MilliporeSigma | A9501 | |
| Clemastine | MilliporeSigma | SML0445 | |
| DMEM/F12 medium | STEMCELL Technologies | 36254 | |
| DMSO | ThermoFisher | D12345 | |
| Doxycycline | MilliporeSigma | D3072 | |
| Fetal Bovine Serum | ScienCell | 10 | |
| H1 human ES cells | WiCell | WA01 | |
| Matrigel | Corning | 354234 | |
| mTeSR plus | STEMCELL Technologies | 5825 | |
| N2 supplement | ThermoFisher | 17502001 | |
| Neurobasal A medium | ThermoFisher | 10888-022 | |
| Non Essential Amino Acids | ThermoFisher | 11140-050 | |
| PDGF-AA | R&D Systems | 221-AA-010 | |
| PEI | VWR | 71002-812 | |
| pMDLg/pRRE | Addgene | 12251 | |
| Polybrene | MilliporeSigma | TR-1003-G | |
| pRSV-REV | Addgene | 12253 | |
| Puromycin | ThermoFisher | A1113803 | |
| ROCK Inhibitor Y-27632 | STEMCELL Technologies | 72302 | |
| SAG | Tocris | 4366 | |
| STEMdiff Neural Progenitor Freezing Media | STEMCELL Technologies | 5838 | |
| STEMdiff SMADi Neural Induction Kit | STEMCELL Technologies | 8581 | |
| T3 triiodothyronine | MilliporeSigma | T6397 | |
| Tempo-iOlogo: Human iPSC-derived OPCs | Tempo BioScience | SKU102 | |
| TetO-Ng2-Puro | Addgene | 52047 | |
| VSV-G | Addgene | 12259 |
References
- Pelvig, D. P., Pakkenberg, H., Stark, A. K., Pakkenberg, B. Neocortical glial cell numbers in human brains. Neurobiology of Aging. 29 (11), 1754-1762 (2008).
- Barres, B. A. The mystery and magic of glia: a perspective on their roles in health and disease. Neuron. 60 (3), 430-440 (2008).
- De Strooper, B., Karran, E. The cellular phase of Alzheimer’s disease. Cell. 164 (4), 603-615 (2016).
- Monje, M. Myelin plasticity and nervous system function. Annual Review of Neuroscience. 41, 61-76 (2018).
- Hughes, E. G., Orthmann-Murphy, J. L., Langseth, A. J., Bergles, D. E. Myelin remodeling through experience-dependent oligodendrogenesis in the adult somatosensory cortex. Nature Neuroscience. 21 (5), 696-706 (2018).
- Gibson, E. M., et al. Neuronal activity promotes oligodendrogenesis and adaptive myelination in the mammalian brain. Science. 344 (6183), 1252304 (2014).
- Pan, S., Mayoral, S. R., Choi, H. S., Chan, J. R., Kheirbek, M. A. Preservation of a remote fear memory requires new myelin formation. Nature Neuroscience. 23 (4), 487-499 (2020).
- Thornton, M. A., Hughes, E. G. Neuron-oligodendroglia interactions: Activity-dependent regulation of cellular signaling. Neuroscience Letters. 727, 134916 (2020).
- Ettle, B., Schlachetzki, J. C. M., Winkler, J. Oligodendroglia and myelin in neurodegenerative diseases: more than just bystanders. Molecular Neurobiology. 53 (5), 3046-3062 (2016).
- Essayan-Perez, S., Zhou, B., Nabet, A. M., Wernig, M., Huang, Y. A. Modeling Alzheimer’s disease with human iPS cells: advancements, lessons, and applications. Neurobiology of Disease. 130, 104503 (2019).
- Li, L., et al. GFAP mutations in astrocytes impair oligodendrocyte progenitor proliferation and myelination in an hiPSC model of Alexander disease. Cell Stem Cell. 23 (2), 239-251 (2018).
- Lin, Y. T., et al. APOE4 causes widespread molecular and cellular alterations associated with Alzheimer’s disease phenotypes in human iPSC-derived brain cell types. Neuron. 98 (6), 1294 (2018).
- TCW, J., et al. Cholesterol and matrisome pathways dysregulated in human APOE ε4 glia. bioRxiv. , (2019).
- Ang, C. E., Wernig, M. Induced neuronal reprogramming. Journal of Comparitive Neurology. 522 (12), 2877-2886 (2014).
- Penney, J., Ralvenius, W. T., Tsai, L. H. Modeling Alzheimer’s disease with iPSC-derived brain cells. Molecular Psychiatry. 25 (1), 148-167 (2020).
- Zhang, Y., et al. Rapid single-step induction of functional neurons from human pluripotent stem cells. Neuron. 78 (5), 785-798 (2013).
- Huang, Y. A., Zhou, B., Nabet, A. M., Wernig, M., Sudhof, T. C. Differential signaling mediated by ApoE2, ApoE3, and ApoE4 in human neurons parallels Alzheimer’s Disease risk. Journal of Neuroscience. 39 (37), 7408-7427 (2019).
- Huang, Y. A., Zhou, B., Wernig, M., Sudhof, T. C. ApoE2, ApoE3, and ApoE4 Differentially Stimulate APP Transcription and Abeta Secretion. Cell. 168 (3), 427-441 (2017).
- Yang, N., et al. Generation of oligodendroglial cells by direct lineage conversion. Nature Biotechnology. 31 (5), 434-439 (2013).
- Douvaras, P., et al. Efficient generation of myelinating oligodendrocytes from primary progressive multiple sclerosis patients by induced pluripotent stem cells. Stem Cell Reports. 3 (2), 250-259 (2014).
- Lee, E. H., Park, C. H. Comparison of reprogramming methods for generation of induced-oligodendrocyte precursor cells. Biomolecules & Therapeutics (Seoul). 25 (4), 362-366 (2017).
- Ehrlich, M., et al. Rapid and efficient generation of oligodendrocytes from human induced pluripotent stem cells using transcription factors. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 114 (11), 2243-2252 (2017).
- Rodrigues, G. M. C., et al. Defined and scalable differentiation of human oligodendrocyte precursors from pluripotent stem cells in a 3D culture system. Stem Cell Reports. 8 (6), 1770-1783 (2017).
- Hu, B. Y., Du, Z. W., Li, X. J., Ayala, M., Zhang, S. C. Human oligodendrocytes from embryonic stem cells: conserved SHH signaling networks and divergent FGF effects. Development. 136 (9), 1443-1452 (2009).
- Izrael, M., et al. Human oligodendrocytes derived from embryonic stem cells: Effect of noggin on phenotypic differentiation in vitro and on myelination in vivo. Molecular and Cellular Neuroscience. 34 (3), 310-323 (2007).
- Yamashita, T., et al. Differentiation of oligodendrocyte progenitor cells from dissociated monolayer and feeder-free cultured pluripotent stem cells. PLoS One. 12 (2), 0171947 (2017).
- Wang, S., et al. Human iPSC-derived oligodendrocyte progenitor cells can myelinate and rescue a mouse model of congenital hypomyelination. Cell Stem Cell. 12 (2), 252-264 (2013).
- Chanoumidou, K., Mozafari, S., Baron-Van Evercooren, A., Kuhlmann, T. Stem cell derived oligodendrocytes to study myelin diseases. Glia. 68 (4), 705-720 (2020).
- Chetty, S., et al. A simple tool to improve pluripotent stem cell differentiation. Nature Methods. 10 (6), 553-556 (2013).
- Li, J., et al. A transient DMSO treatment increases the differentiation potential of human pluripotent stem cells through the Rb family. PLoS One. 13 (12), 0208110 (2018).
- Sambo, D., Li, J., Brickler, T., Chetty, S. Transient treatment of human pluripotent stem cells with DMSO to promote differentiation. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (149), (2019).
- Douvaras, P., Fossati, V. Generation and isolation of oligodendrocyte progenitor cells from human pluripotent stem cells. Nature Protocols. 10 (8), 1143-1154 (2015).
- Mei, F., et al. Micropillar arrays as a high-throughput screening platform for therapeutics in multiple sclerosis. Nature Medicine. 20 (8), 954-960 (2014).
- Madhavan, M., et al. Induction of myelinating oligodendrocytes in human cortical spheroids. Nature Methods. 15 (9), 700-706 (2018).
- Zhang, Y., et al. Purification and characterization of progenitor and mature human astrocytes reveals transcriptional and functional differences with mouse. Neuron. 89 (1), 37-53 (2016).
- Grubman, A., et al. A single-cell atlas of entorhinal cortex from individuals with Alzheimer’s disease reveals cell-type-specific gene expression regulation. Nature Neuroscience. 22 (12), 2087-2097 (2019).
- Goldman, S. A., Kuypers, N. J. How to make an oligodendrocyte. Development. 142 (23), 3983-3995 (2015).
- Behrendt, G., et al. Dynamic changes in myelin aberrations and oligodendrocyte generation in chronic amyloidosis in mice and men. Glia. 61 (2), 273-286 (2013).
- Patzke, C., et al. Neuromodulator signaling bidirectionally controls vesicle numbers in human synapses. Cell. 179 (2), 498-513 (2019).
- Piao, J., et al. Human embryonic stem cell-derived oligodendrocyte progenitors remyelinate the brain and rescue behavioral deficits following radiation. Cell Stem Cell. 16 (2), 198-210 (2015).
- Keirstead, H. S., et al. Human embryonic stem cell-derived oligodendrocyte progenitor cell transplants remyelinate and restore locomotion after spinal cord injury. Journal of Neuroscience. 25 (19), 4694-4705 (2005).
- Kim, D. S., et al. Rapid generation of OPC-like cells from human pluripotent stem cells for treating spinal cord injury. Experimental & Molecular Medicine. 49 (7), 361 (2017).
