التفاعلات العصبية الدبقية في التنكس العصبي ليست مفهومة جيدا بسبب عدم كفاية الأدوات والأساليب. هنا ، نصف البروتوكولات المثلى للحصول على الخلايا العصبية المستحثة ، وخلايا سلائف الخلايا قليلة التغصن ، والخلايا قليلة التغصن من الخلايا الجذعية البشرية متعددة القدرات ونقدم أمثلة على قيم هذه الطرق في فهم المساهمات الخاصة بنوع الخلية في مرض الزهايمر.
في مرض الزهايمر (AD) والاضطرابات التنكسية العصبية الأخرى ، يعد الفشل الدبقي قليل التغصن سمة مرضية مبكرة شائعة ، ولكن كيف يساهم في تطور المرض وتطوره ، خاصة في المادة الرمادية للدماغ ، لا يزال غير معروف إلى حد كبير. يتميز الخلل الوظيفي لخلايا سلالة الخلايا قليلة التغصن بأوجه القصور في الميالين وضعف التجديد الذاتي لخلايا سلائف الخلايا قليلة التغصن (OPCs). يحدث هذان العيبان جزئيا على الأقل بسبب اضطراب التفاعلات بين الخلايا العصبية والخلايا قليلة التغصن على طول تراكم علم الأمراض. تؤدي OPCs إلى ظهور الخلايا قليلة التغصن الميالينية أثناء تطور الجهاز العصبي المركزي. في قشرة الدماغ الناضجة ، OPCs هي الخلايا التكاثرية الرئيسية (التي تضم ~ 5 ٪ من إجمالي خلايا الدماغ) وتتحكم في تكوين المايلين الجديد بطريقة تعتمد على النشاط العصبي. لم تتم دراسة مثل هذه الاتصالات من الخلايا العصبية إلى الخلايا العصبية قليلة التغصن بشكل كبير ، خاصة في سياق الحالات التنكسية العصبية مثل مرض الزهايمر ، بسبب نقص الأدوات المناسبة. في السنوات الأخيرة ، أحرزت مجموعتنا وغيرها تقدما كبيرا لتحسين البروتوكولات المتاحة حاليا لتوليد الخلايا العصبية الوظيفية والخلايا قليلة التغصن بشكل فردي من الخلايا الجذعية البشرية متعددة القدرات. في هذه المخطوطة ، نصف إجراءاتنا المحسنة ، بما في ذلك إنشاء نظام زراعة مشتركة لنمذجة اتصالات الخلايا العصبية قليلة التغصن. تشير نتائجنا التوضيحية إلى مساهمة غير متوقعة من OPCs / oligodendrocytes في الداء النشواني في الدماغ وسلامة المشبك العصبي وتسليط الضوء على فائدة هذه المنهجية لأبحاث مرض الزهايمر. هذا النهج الاختزالي هو أداة قوية لتشريح التفاعلات الخلوية غير المتجانسة المحددة من التعقيد المتأصل داخل الدماغ. من المتوقع أن تسهل البروتوكولات التي نصفها هنا الدراسات المستقبلية حول عيوب قلة التغصن في التسبب في التنكس العصبي.
تشكل خلايا سلالة الخلايا قليلة التغصن – بما في ذلك خلايا سلائف الخلايا قليلة التغصن (OPCs) ، والخلايا قليلة التغصن الميالينية ، والأنواع الانتقالية بينهما – مجموعة رئيسية من خلايا الدماغ البشرية1 التي تشارك بنشاط في العديد من الوظائف الحيوية من أجل التشغيل السليم وصيانة نظامنا العصبي المركزي طوال التطور العصبي والشيخوخة2،3،4 . في حين أن oligodendrocytes معروفة جيدا بإنتاج المايلين لتسهيل انتقال النشاط العصبي ودعم الصحة المحورية في المادة البيضاء ، فإن OPCs وفيرة (~ 5٪) في المادة الرمادية حيث يكون الميالين نادرا وتؤدي وظائف إشارات تعتمد على النشاط للتحكم في سلوك التعلم وتكوين الذاكرة5،6،7،8 . كيف تعمل الخلايا الدبقية قليلة التغصن والخلل الوظيفي في التسبب في مرض الزهايمر (AD) وغيرها من الحالات التنكسية العصبية المرتبطة بالعمر لم تتم دراستها9. وتتمثل أوجه القصور في نظام نموذجي مناسب وأوجه القصور في المعارف العامة لتوجيه مسار تجريبي إلى الأمام في الأسباب الرئيسية لهذه الفجوة.
في ضوء أحدث الاختراقات في اشتقاق خلايا الدماغ البشري من الخلايا الجذعية متعددة القدرات بما في ذلك الخلايا الجذعية الجنينية (ES) والخلايا الجذعية المستحثة متعددة القدرات (iPS) ، ظهرت هذه النماذج الخلوية جنبا إلى جنب مع أدوات تحرير الجينات الحديثة كأدوات قوية للتعامل مع العلاقة المعقدة للتفاعلات الخلوية في الدماغ ، وهي قادرة على إظهار مظاهر المرض الخاصة بالإنسان10 ، 11. بالنظر إلى أن أنواع خلايا الدماغ الفردية يمكن أن تظهر تأثيرات مميزة وحتى متضاربة في مواجهة نفس الظروف المعززة لمرض الزهايمر12,13 ، فإن منهجية الخلايا الجذعية هذه تقدم بشكل فريد معلومات خاصة بنوع الخلية تم تفويتها سابقا باستخدام نماذج ثابتة في الجسم الحي أو في المختبر توفر فقط قراءات مجمعة من مجموعات من أنواع خلايا الدماغ. في العقد الماضي ، تم تطوير عدد كبير من البروتوكولات الموثوقة لتوليد الخلايا العصبية البشرية من التمايز العابر للخلايا الجذعية الجنينية / الجذعية المستحثة متعددة القدرات أو التحويل المباشر من أنواع الخلايا الأخرى المتمايزة نهائيا (مثل الخلايا الليفية)14,15. على وجه الخصوص ، يمكن أن يؤدي تطبيق عوامل النسخ العصبية الرئيسية (على سبيل المثال ، neurogenin 2 ، Ngn2)16 على الخلايا الجذعية البشرية متعددة القدرات إلى توليد مجموعة متجانسة من أنواع الخلايا العصبية المميزة جيدا للمزارع النقية دون الحاجة إلى التثاقف مع الخلايا الدبقية12،17،18. بالنسبة للخلايا قليلة التغصن البشرية المستحثة ، هناك عدد قليل من البروتوكولات المنشورة التي يمكن أن تولد خلايا وظيفية تشبه إلى حد كبير نظيراتها الأولية ، مع مجموعة واسعة من الكفاءة والطلب في الوقت والموارد19،20،21،22،23،24،25،26،27،28 . حتى الآن ، لم يتم تطبيق أي من هذه البروتوكولات للتحقيق في كيفية استجابة الخلايا قليلة التغصن وتأثيرها على التسبب في مرض الزهايمر.
هنا ، نصف بروتوكولاتنا المحسنة للثقافات الفردية والمختلطة للخلايا العصبية المستحثة البشرية (iNs) و OPCs / oligodendrocytes (iOPCs / iOLs). يعتمد بروتوكول iN الموصوف هنا على نهج Ngn216 المستخدم على نطاق واسع ، وله ميزة إضافية تتمثل في كونه خاليا من الدبقية. تكون iNs الناتجة متجانسة وتشبه إلى حد كبير الخلايا العصبية المثيرة للطبقة القشرية 2/3 ، مع مورفولوجيا هرمية مميزة ونمط التعبير الجيني وميزات فيزيولوجية كهربية17,18 (الشكل 1). للتغلب على بعض الحواجز الأساسية في التمايز الموجه للخلايا الجذعية متعددة القدرات ، قمنا بتطوير طريقة بسيطة وفعالة للمعالجة المسبقة لجرعة منخفضة من ثنائي ميثيل سلفوكسيد (DMSO)29،30 ، وأبلغنا عن ميل معزز لخلايا ES / iPS البشرية للانتقال إلى iOPCs و iOLs31 ، بناء على بروتوكول تم تكييفه على نطاق واسع بواسطة Douvaras و Fossati 32 . لقد قمنا بتبسيط البروتوكول بشكل أكبر ودمجنا مركبا قويا يعزز التمايز ، كليماستين7،33،34 ، لتسريع عملية النضج الدبقي قليل التغصن. نتيجة لذلك (الشكل 2) ، يمكن إنشاء iOPCs في أسبوعين (~ 95٪ إيجابي للعلامة O4) و iOLs في أربعة أسابيع (معبرا عن علامات ناضجة MBP و PLP1). ومن المثير للاهتمام ، وجدنا أن iOPCs وحدها تفرز كمية ملحوظة من β الأميلويد (Aβ) ، بما يتفق مع البيانات النسخية المستقلة التي تظهر التعبير الوفير لبروتين السلائف الأميلويد (APP) ومعالجة البروتياز β-secretase (BACE1) في خلايا سلالة الخلايا قليلة التغصن35,36. علاوة على ذلك ، يعزز نظام الاستزراع المشترك iN-iOPC الخاص بنا تغليف المحاور من خلال عمليات iOL الإيجابية MBP ويوفر دعما كبيرا لتشكيل المشبك العصبي (الشكل 3). وبالتالي ، فإن البروتوكولات التي قمنا بتفصيلها أدناه لها مزايا تقنية وبيولوجية على طرق الاستزراع المشترك للخلايا العصبية قليلة التغصن المفهرسة سابقا ، وتبشر بنمذجة أفضل للتنكس العصبي في مرض الزهايمر.
بالإضافة إلى الدعم الجسدي والأيضي لتحقيق الاستقرار في هياكل المشبك وتسهيل توصيل الإشارة الملحية عن طريق الميالين ، يمكن لخلايا سلالة oligodendrocyte تشكيل نمط النشاط العصبي عبر محادثات متقاطعة سريعة وديناميكية مع الخلايا العصبية5،6،7. بينما في…
The authors have nothing to disclose.
تم دعم هذا العمل من خلال المنح المقدمة من المعاهد الوطنية للصحة (R00 AG054616 إلى YAH و T32 GM136566 إلى KC) ، وكلية الطب بجامعة ستانفورد وزمالة Siebel (الممنوحة ل SC). Y.A.H. هو أستاذ متعدية في GFL من مركز علم الأعصاب الانتقالي في معهد براون للعلوم الانتقالية.
Accutase | STEMCELL Technologies | 7920 | |
B27 supplement | ThermoFisher | 17504044 | |
bFGF | ThermoFisher | PHG 0266 | |
cAMP | MilliporeSigma | A9501 | |
Clemastine | MilliporeSigma | SML0445 | |
DMEM/F12 medium | STEMCELL Technologies | 36254 | |
DMSO | ThermoFisher | D12345 | |
Doxycycline | MilliporeSigma | D3072 | |
Fetal Bovine Serum | ScienCell | 10 | |
H1 human ES cells | WiCell | WA01 | |
Matrigel | Corning | 354234 | |
mTeSR plus | STEMCELL Technologies | 5825 | |
N2 supplement | ThermoFisher | 17502001 | |
Neurobasal A medium | ThermoFisher | 10888-022 | |
Non Essential Amino Acids | ThermoFisher | 11140-050 | |
PDGF-AA | R&D Systems | 221-AA-010 | |
PEI | VWR | 71002-812 | |
pMDLg/pRRE | Addgene | 12251 | |
Polybrene | MilliporeSigma | TR-1003-G | |
pRSV-REV | Addgene | 12253 | |
Puromycin | ThermoFisher | A1113803 | |
ROCK Inhibitor Y-27632 | STEMCELL Technologies | 72302 | |
SAG | Tocris | 4366 | |
STEMdiff Neural Progenitor Freezing Media | STEMCELL Technologies | 5838 | |
STEMdiff SMADi Neural Induction Kit | STEMCELL Technologies | 8581 | |
T3 triiodothyronine | MilliporeSigma | T6397 | |
Tempo-iOlogo: Human iPSC-derived OPCs | Tempo BioScience | SKU102 | |
TetO-Ng2-Puro | Addgene | 52047 | |
VSV-G | Addgene | 12259 |