Generatie van menselijke neuronen en oligodendrocyten uit pluripotente stamcellen voor het modelleren van neuron-oligodendrocyteninteracties
Summary
De neuron-gliale interacties bij neurodegeneratie worden niet goed begrepen als gevolg van ontoereikende hulpmiddelen en methoden. Hier beschrijven we geoptimaliseerde protocollen om geïnduceerde neuronen, oligodendrocytenvoorlopercellen en oligodendrocyten te verkrijgen uit menselijke pluripotente stamcellen en geven we voorbeelden van de waarden van deze methoden bij het begrijpen van celtypespecifieke bijdragen bij de ziekte van Alzheimer.
Abstract
Bij de ziekte van Alzheimer (AD) en andere neurodegeneratieve aandoeningen is oligodendrogliaal falen een veel voorkomend vroeg pathologisch kenmerk, maar hoe het bijdraagt aan de ontwikkeling en progressie van de ziekte, met name in de grijze stof van de hersenen, blijft grotendeels onbekend. De disfunctie van oligodendrocytenafstammingscellen wordt gekenmerkt door tekortkomingen in myelinisatie en verminderde zelfvernieuwing van oligodendrocytenvoorlopercellen (OPC’s). Deze twee defecten worden ten minste gedeeltelijk veroorzaakt door de verstoring van interacties tussen neuronen en oligodendrocyten langs de opbouw van pathologie. OPC’s geven aanleiding tot myeliniserende oligodendrocyten tijdens de ontwikkeling van het CZS. In de volwassen hersenschors zijn OPC’s de belangrijkste proliferatieve cellen (bestaande uit ~ 5% van de totale hersencellen) en controleren nieuwe myelinevorming op een neurale activiteitsafhankelijke manier. Dergelijke neuron-naar-oligodendrocytencommunicatie wordt aanzienlijk onderbelicht, vooral in de context van neurodegeneratieve aandoeningen zoals AD, vanwege het gebrek aan geschikte hulpmiddelen. In de afgelopen jaren hebben onze groep en anderen aanzienlijke vooruitgang geboekt bij het verbeteren van de momenteel beschikbare protocollen om functionele neuronen en oligodendrocyten individueel te genereren uit menselijke pluripotente stamcellen. In dit manuscript beschrijven we onze geoptimaliseerde procedures, waaronder het opzetten van een co-kweeksysteem om de neuron-oligodendrocytenverbindingen te modelleren. Onze illustratieve resultaten suggereren een onverwachte bijdrage van OPC’s / oligodendrocyten aan de amyloïdose van de hersenen en synapsintegriteit en benadrukken het nut van deze methodologie voor AD-onderzoek. Deze reductionistische benadering is een krachtig hulpmiddel om de specifieke hetero-cellulaire interacties te ontleden uit de inherente complexiteit in de hersenen. De protocollen die we hier beschrijven, zullen naar verwachting toekomstige studies naar oligodendrogliale defecten in de pathogenese van neurodegeneratie vergemakkelijken.
Introduction
Oligodendrocytenafstammingscellen – inclusief oligodendrocytenvoorlopercellen (OPC’s), myeliniserende oligodendrocyten en overgangstypen daartussenin – vormen een belangrijke groep menselijke hersencellen1 die actief deelnemen aan vele kritieke functies voor de juiste werking en het onderhoud van ons centrale zenuwstelsel tijdens de neurale ontwikkeling en veroudering 2,3,4 . Hoewel oligodendrocyten bekend staan om het produceren van myeline om de overdracht van neuronale activiteit te vergemakkelijken en de axonale gezondheid in witte stof te ondersteunen, zijn OPC’s overvloedig (~ 5%) in grijze stof waar myelinisatie schaars is en voeren activiteitsafhankelijke signaleringsfuncties uit om leergedrag en geheugenvorming te regelen 5,6,7,8 . Hoe oligodendrogliale cellen functioneren en disfunctie in de pathogenese van de ziekte van Alzheimer (AD) en andere leeftijdsgebonden neurodegeneratieve aandoeningen is onderbelicht9. De tekortkomingen van een geschikt modelsysteem en tekortkomingen in de algemene kennis om een experimenteel pad voorwaarts te begeleiden, zijn de belangrijkste redenen voor deze kloof.
In het licht van de laatste doorbraken in het afleiden van menselijke hersencellen uit pluripotente stamcellen, waaronder embryonale stamcellen (ES) en geïnduceerde pluripotente stamcellen (iPS), zijn dergelijke cellulaire modellen in combinatie met moderne genbewerkingstools naar voren gekomen als robuuste hulpmiddelen om de ingewikkelde nexus van cellulaire interacties in de hersenen aan te pakken, en zijn ze in staat om mensspecifieke ziekteverschijnselen aan te tonen10, 11. Gezien het feit dat individuele hersenceltypen verschillende en zelfs conflicterende effecten kunnen vertonen in het licht van dezelfde AD-bevorderende aandoeningen12,13, biedt deze stamcelmethodologie op unieke wijze celtypespecifieke informatie die eerder is gemist met behulp van gevestigde in vivo of in vitro modellen die alleen geaggregeerde uitlezingen bieden van verzamelingen hersenceltypen. In het afgelopen decennium zijn een groot aantal betrouwbare protocollen ontwikkeld om menselijke neuronen te genereren uit transdifferentiatie van ES / iPS-cellen of directe conversie van andere terminaal gedifferentieerde celtypen (bijv. Fibroblasten)14,15. In het bijzonder kan de toepassing van belangrijke neurogene transcriptiefactoren (bijv. neurogenine 2, Ngn2)16 op menselijke pluripotente stamcellen een homogene populatie van goed gekarakteriseerde neuronale celtypen genereren voor zuivere culturen zonder dat er behoefte is aan coculturing met gliacellen 12,17,18. Voor geïnduceerde menselijke oligodendrocyten zijn er een paar gepubliceerde protocollen die functionele cellen kunnen genereren die sterk lijken op hun primaire tegenhangers, met een breed scala aan efficiëntie en vraag in tijd en middelen 19,20,21,22,23,24,25,26,27,28 . Tot op heden is geen van deze protocollen toegepast om te onderzoeken hoe oligodendrogliale cellen reageren op en invloed hebben op AD-pathogenese.
Hier beschrijven we onze verbeterde protocollen voor enkelvoudige en gemengde culturen van door de mens geïnduceerde neuronen (iN’s) en OPC’s/oligodendrocyten (iOPCs/iOL’s). Het hier beschreven iN-protocol is gebaseerd op de veelgebruikte Ngn2-benadering16 en heeft als extra eigenschap gliavrij te zijn. De resulterende iNs zijn homogeen en lijken sterk op de corticale laag 2/3 exciterende neuronen, met karakteristieke piramidale morfologie, genexpressiepatroon en elektrofysiologische kenmerken17,18 (figuur 1). Om enkele van de fundamentele barrières bij gerichte differentiatie van pluripotente stamcellen te overwinnen, hebben we een eenvoudige en effectieve methode ontwikkeld voor de voorbehandeling van lage doses dimethylsulfoxide (DMSO)29,30, en rapporteerden we een verhoogde neiging van menselijke ES / iPS-cellen om te transdifferentiëren in iOPCs en iOL’s31, gebaseerd op een breed aangepast protocol van Douvaras en Fossati32 . We hebben het protocol verder vereenvoudigd en een robuuste differentiatiebevorderende verbinding, clemastine 7,33,34, opgenomen om het proces van oligodendrogliale rijping te versnellen. Als gevolg hiervan (figuur 2) kunnen de iOPCs worden gegenereerd in 2 weken (~ 95% positief voor de marker O4) en iOL’s in vier weken (met volwassen markers MBP en PLP1). Interessant is dat we ontdekten dat iOPCs alleen een opmerkelijke hoeveelheid amyloïde-β (Aβ) afscheiden, consistent met de onafhankelijke transcriptomische gegevens die de overvloedige expressie van het amyloïde precursoreiwit (APP) en het verwerkingsprotease β-secretase (BACE1) in oligodendrocytenlijncellen35,36 aantonen. Bovendien bevordert ons iN-iOPC cocultuursysteem de opwarming van axonen door MBP-positieve iOL-processen en biedt het aanzienlijke ondersteuning voor synapsvorming (figuur 3). De protocollen die we hieronder hebben beschreven, hebben dus technische en biologische voordelen ten opzichte van eerder gecatalogiseerde neuron-oligodendroglia co-cultiveringsmethoden en houden een belofte in bij het beter modelleren van de neurodegeneratie in AD.
Protocol
Representative Results
Discussion
Naast de fysieke en metabole ondersteuning om de synapsstructuren te stabiliseren en de zoute signaalgeleiding door myelinisatie te vergemakkelijken, kunnen oligodendrocytenafstammingscellen een neuronaal activiteitspatroon vormen via snelle en dynamische kruisgesprekken met neuronen 5,6,7. Terwijl in de AD-pathologie de oligodendrogliale responsen aanvankelijk werden beschouwd als slechts secundair aan ontsteking en oxidatieve …
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Dit werk werd ondersteund door de subsidies van National Institutes of Health (R00 AG054616 aan Y.A.H. en T32 GM136566 aan K.C.), Stanford University School of Medicine en een Siebel Fellowship (toegekend aan S.C.). Y.A.H. is een GFL Translational Professor van het Center for Translational Neuroscience in het Brown Institute for Translational Sciences.
Materials
| Accutase | STEMCELL Technologies | 7920 | |
| B27 supplement | ThermoFisher | 17504044 | |
| bFGF | ThermoFisher | PHG 0266 | |
| cAMP | MilliporeSigma | A9501 | |
| Clemastine | MilliporeSigma | SML0445 | |
| DMEM/F12 medium | STEMCELL Technologies | 36254 | |
| DMSO | ThermoFisher | D12345 | |
| Doxycycline | MilliporeSigma | D3072 | |
| Fetal Bovine Serum | ScienCell | 10 | |
| H1 human ES cells | WiCell | WA01 | |
| Matrigel | Corning | 354234 | |
| mTeSR plus | STEMCELL Technologies | 5825 | |
| N2 supplement | ThermoFisher | 17502001 | |
| Neurobasal A medium | ThermoFisher | 10888-022 | |
| Non Essential Amino Acids | ThermoFisher | 11140-050 | |
| PDGF-AA | R&D Systems | 221-AA-010 | |
| PEI | VWR | 71002-812 | |
| pMDLg/pRRE | Addgene | 12251 | |
| Polybrene | MilliporeSigma | TR-1003-G | |
| pRSV-REV | Addgene | 12253 | |
| Puromycin | ThermoFisher | A1113803 | |
| ROCK Inhibitor Y-27632 | STEMCELL Technologies | 72302 | |
| SAG | Tocris | 4366 | |
| STEMdiff Neural Progenitor Freezing Media | STEMCELL Technologies | 5838 | |
| STEMdiff SMADi Neural Induction Kit | STEMCELL Technologies | 8581 | |
| T3 triiodothyronine | MilliporeSigma | T6397 | |
| Tempo-iOlogo: Human iPSC-derived OPCs | Tempo BioScience | SKU102 | |
| TetO-Ng2-Puro | Addgene | 52047 | |
| VSV-G | Addgene | 12259 |
References
- Pelvig, D. P., Pakkenberg, H., Stark, A. K., Pakkenberg, B. Neocortical glial cell numbers in human brains. Neurobiology of Aging. 29 (11), 1754-1762 (2008).
- Barres, B. A. The mystery and magic of glia: a perspective on their roles in health and disease. Neuron. 60 (3), 430-440 (2008).
- De Strooper, B., Karran, E. The cellular phase of Alzheimer’s disease. Cell. 164 (4), 603-615 (2016).
- Monje, M. Myelin plasticity and nervous system function. Annual Review of Neuroscience. 41, 61-76 (2018).
- Hughes, E. G., Orthmann-Murphy, J. L., Langseth, A. J., Bergles, D. E. Myelin remodeling through experience-dependent oligodendrogenesis in the adult somatosensory cortex. Nature Neuroscience. 21 (5), 696-706 (2018).
- Gibson, E. M., et al. Neuronal activity promotes oligodendrogenesis and adaptive myelination in the mammalian brain. Science. 344 (6183), 1252304 (2014).
- Pan, S., Mayoral, S. R., Choi, H. S., Chan, J. R., Kheirbek, M. A. Preservation of a remote fear memory requires new myelin formation. Nature Neuroscience. 23 (4), 487-499 (2020).
- Thornton, M. A., Hughes, E. G. Neuron-oligodendroglia interactions: Activity-dependent regulation of cellular signaling. Neuroscience Letters. 727, 134916 (2020).
- Ettle, B., Schlachetzki, J. C. M., Winkler, J. Oligodendroglia and myelin in neurodegenerative diseases: more than just bystanders. Molecular Neurobiology. 53 (5), 3046-3062 (2016).
- Essayan-Perez, S., Zhou, B., Nabet, A. M., Wernig, M., Huang, Y. A. Modeling Alzheimer’s disease with human iPS cells: advancements, lessons, and applications. Neurobiology of Disease. 130, 104503 (2019).
- Li, L., et al. GFAP mutations in astrocytes impair oligodendrocyte progenitor proliferation and myelination in an hiPSC model of Alexander disease. Cell Stem Cell. 23 (2), 239-251 (2018).
- Lin, Y. T., et al. APOE4 causes widespread molecular and cellular alterations associated with Alzheimer’s disease phenotypes in human iPSC-derived brain cell types. Neuron. 98 (6), 1294 (2018).
- TCW, J., et al. Cholesterol and matrisome pathways dysregulated in human APOE ε4 glia. bioRxiv. , (2019).
- Ang, C. E., Wernig, M. Induced neuronal reprogramming. Journal of Comparitive Neurology. 522 (12), 2877-2886 (2014).
- Penney, J., Ralvenius, W. T., Tsai, L. H. Modeling Alzheimer’s disease with iPSC-derived brain cells. Molecular Psychiatry. 25 (1), 148-167 (2020).
- Zhang, Y., et al. Rapid single-step induction of functional neurons from human pluripotent stem cells. Neuron. 78 (5), 785-798 (2013).
- Huang, Y. A., Zhou, B., Nabet, A. M., Wernig, M., Sudhof, T. C. Differential signaling mediated by ApoE2, ApoE3, and ApoE4 in human neurons parallels Alzheimer’s Disease risk. Journal of Neuroscience. 39 (37), 7408-7427 (2019).
- Huang, Y. A., Zhou, B., Wernig, M., Sudhof, T. C. ApoE2, ApoE3, and ApoE4 Differentially Stimulate APP Transcription and Abeta Secretion. Cell. 168 (3), 427-441 (2017).
- Yang, N., et al. Generation of oligodendroglial cells by direct lineage conversion. Nature Biotechnology. 31 (5), 434-439 (2013).
- Douvaras, P., et al. Efficient generation of myelinating oligodendrocytes from primary progressive multiple sclerosis patients by induced pluripotent stem cells. Stem Cell Reports. 3 (2), 250-259 (2014).
- Lee, E. H., Park, C. H. Comparison of reprogramming methods for generation of induced-oligodendrocyte precursor cells. Biomolecules & Therapeutics (Seoul). 25 (4), 362-366 (2017).
- Ehrlich, M., et al. Rapid and efficient generation of oligodendrocytes from human induced pluripotent stem cells using transcription factors. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 114 (11), 2243-2252 (2017).
- Rodrigues, G. M. C., et al. Defined and scalable differentiation of human oligodendrocyte precursors from pluripotent stem cells in a 3D culture system. Stem Cell Reports. 8 (6), 1770-1783 (2017).
- Hu, B. Y., Du, Z. W., Li, X. J., Ayala, M., Zhang, S. C. Human oligodendrocytes from embryonic stem cells: conserved SHH signaling networks and divergent FGF effects. Development. 136 (9), 1443-1452 (2009).
- Izrael, M., et al. Human oligodendrocytes derived from embryonic stem cells: Effect of noggin on phenotypic differentiation in vitro and on myelination in vivo. Molecular and Cellular Neuroscience. 34 (3), 310-323 (2007).
- Yamashita, T., et al. Differentiation of oligodendrocyte progenitor cells from dissociated monolayer and feeder-free cultured pluripotent stem cells. PLoS One. 12 (2), 0171947 (2017).
- Wang, S., et al. Human iPSC-derived oligodendrocyte progenitor cells can myelinate and rescue a mouse model of congenital hypomyelination. Cell Stem Cell. 12 (2), 252-264 (2013).
- Chanoumidou, K., Mozafari, S., Baron-Van Evercooren, A., Kuhlmann, T. Stem cell derived oligodendrocytes to study myelin diseases. Glia. 68 (4), 705-720 (2020).
- Chetty, S., et al. A simple tool to improve pluripotent stem cell differentiation. Nature Methods. 10 (6), 553-556 (2013).
- Li, J., et al. A transient DMSO treatment increases the differentiation potential of human pluripotent stem cells through the Rb family. PLoS One. 13 (12), 0208110 (2018).
- Sambo, D., Li, J., Brickler, T., Chetty, S. Transient treatment of human pluripotent stem cells with DMSO to promote differentiation. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (149), (2019).
- Douvaras, P., Fossati, V. Generation and isolation of oligodendrocyte progenitor cells from human pluripotent stem cells. Nature Protocols. 10 (8), 1143-1154 (2015).
- Mei, F., et al. Micropillar arrays as a high-throughput screening platform for therapeutics in multiple sclerosis. Nature Medicine. 20 (8), 954-960 (2014).
- Madhavan, M., et al. Induction of myelinating oligodendrocytes in human cortical spheroids. Nature Methods. 15 (9), 700-706 (2018).
- Zhang, Y., et al. Purification and characterization of progenitor and mature human astrocytes reveals transcriptional and functional differences with mouse. Neuron. 89 (1), 37-53 (2016).
- Grubman, A., et al. A single-cell atlas of entorhinal cortex from individuals with Alzheimer’s disease reveals cell-type-specific gene expression regulation. Nature Neuroscience. 22 (12), 2087-2097 (2019).
- Goldman, S. A., Kuypers, N. J. How to make an oligodendrocyte. Development. 142 (23), 3983-3995 (2015).
- Behrendt, G., et al. Dynamic changes in myelin aberrations and oligodendrocyte generation in chronic amyloidosis in mice and men. Glia. 61 (2), 273-286 (2013).
- Patzke, C., et al. Neuromodulator signaling bidirectionally controls vesicle numbers in human synapses. Cell. 179 (2), 498-513 (2019).
- Piao, J., et al. Human embryonic stem cell-derived oligodendrocyte progenitors remyelinate the brain and rescue behavioral deficits following radiation. Cell Stem Cell. 16 (2), 198-210 (2015).
- Keirstead, H. S., et al. Human embryonic stem cell-derived oligodendrocyte progenitor cell transplants remyelinate and restore locomotion after spinal cord injury. Journal of Neuroscience. 25 (19), 4694-4705 (2005).
- Kim, D. S., et al. Rapid generation of OPC-like cells from human pluripotent stem cells for treating spinal cord injury. Experimental & Molecular Medicine. 49 (7), 361 (2017).
