Summary

Generación de neuronas humanas y oligodendrocitos a partir de células madre pluripotentes para modelar las interacciones neuronal-oligodendrocitos

Published: November 09, 2020
doi:

Summary

Las interacciones neurona-glial en la neurodegeneración no se comprenden bien debido a herramientas y métodos inadecuados. Aquí, describimos protocolos optimizados para obtener neuronas inducidas, células precursoras de oligodendrocitos y oligodendrocitos a partir de células madre pluripotentes humanas y proporcionamos ejemplos de los valores de estos métodos para comprender las contribuciones específicas del tipo de célula en la enfermedad de Alzheimer.

Abstract

En la enfermedad de Alzheimer (EA) y otros trastornos neurodegenerativos, la insuficiencia oligodendroglial es una característica patológica temprana común, pero la forma en que contribuye al desarrollo y progresión de la enfermedad, particularmente en la materia gris del cerebro, sigue siendo en gran parte desconocida. La disfunción de las células del linaje de oligodendrocitos se caracteriza por deficiencias en la mielinización y alteración de la auto-renovación de las células precursoras de oligodendrocitos (OPC). Estos dos defectos son causados, al menos en parte, por la interrupción de las interacciones entre la neurona y los oligodendrocitos a lo largo de la acumulación de patología. Las OPC dan lugar a oligodendrocitos mielinizantes durante el desarrollo del SNC. En la corteza cerebral madura, las OPC son las principales células proliferativas (que comprenden ~ 5% del total de células cerebrales) y controlan la formación de nueva mielina de una manera dependiente de la actividad neuronal. Tales comunicaciones neuronómicas a oligodendrocitos están significativamente poco estudiadas, especialmente en el contexto de afecciones neurodegenerativas como la EA, debido a la falta de herramientas adecuadas. En los últimos años, nuestro grupo y otros han hecho progresos significativos para mejorar los protocolos actualmente disponibles para generar neuronas funcionales y oligodendrocitos individualmente a partir de células madre pluripotentes humanas. En este manuscrito, describimos nuestros procedimientos optimizados, incluido el establecimiento de un sistema de cocultivo para modelar las conexiones neurona-oligodendrocitos. Nuestros resultados ilustrativos sugieren una contribución inesperada de OPC / oligodendrocitos a la amiloidosis cerebral y la integridad de la sinapsis y destacan la utilidad de esta metodología para la investigación de la EA. Este enfoque reduccionista es una herramienta poderosa para diseccionar las interacciones heterocelulares específicas de la complejidad inherente dentro del cerebro. Se espera que los protocolos que describimos aquí faciliten futuros estudios sobre defectos oligodendrogliales en la patogénesis de la neurodegeneración.

Introduction

Las células del linaje de oligodendrocitos, incluidas las células precursoras de oligodendrocitos (OPC), los oligodendrocitos mielinizantes y los tipos de transición intermedios, constituyen un grupo importante de células cerebrales humanas1 que participan activamente en muchas funciones críticas para el correcto funcionamiento y mantenimiento de nuestro sistema nervioso central a lo largo del desarrollo neuronal y el envejecimiento 2,3,4 . Mientras que los oligodendrocitos son bien conocidos por producir mielina para facilitar la transmisión de la actividad neuronal y apoyar la salud axonal en la sustancia blanca, los OPC son abundantes (~ 5%) en la materia gris donde la mielinización es escasa y realizan funciones de señalización dependientes de la actividad para gobernar el comportamiento de aprendizaje y la formación de la memoria 5,6,7,8 . La forma en que las células oligodendrogliales funcionan y la disfunción en la patogénesis de la enfermedad de Alzheimer (EA) y otras afecciones neurodegenerativas asociadas a la edad han sido poco estudiadas9. Las insuficiencias de un sistema modelo apropiado y las deficiencias en el conocimiento general para guiar un camino experimental hacia adelante son las principales razones de esta brecha.

A la luz de los últimos avances en la obtención de células cerebrales humanas a partir de células madre pluripotentes, incluidas las células madre embrionarias (ES) y las células madre pluripotentes inducidas (iPS), tales modelos celulares junto con las herramientas modernas de edición de genes han surgido como herramientas robustas para manejar el intrincado nexo de las interacciones celulares en el cerebro, y son capaces de demostrar manifestaciones de enfermedades específicas del ser humano10, 11. Teniendo en cuenta que los tipos individuales de células cerebrales pueden exhibir efectos distintos e incluso conflictivos frente a las mismas condiciones promotoras de la EA12,13, esta metodología de células madre ofrece de manera única información específica del tipo de célula que anteriormente se había pasado por alto utilizando modelos establecidos in vivo o in vitro que solo proporcionan lecturas agregadas de colecciones de tipos de células cerebrales. En la última década, se han desarrollado un buen número de protocolos confiables para generar neuronas humanas a partir de la transdiferenciación de células ES/iPS o la conversión directa de otros tipos de células diferenciadas terminalmente (por ejemplo, fibroblastos)14,15. En particular, la aplicación de factores de transcripción neurogénicos clave (por ejemplo, neurogenina 2, Ngn2)16 a células madre pluripotentes humanas puede generar una población homogénea de tipos de células neuronales bien caracterizadas para cultivos puros sin necesidad de cocultivo con células gliales12,17,18. Para los oligodendrocitos humanos inducidos, hay algunos protocolos publicados que pueden generar células funcionales muy parecidas a sus contrapartes primarias, con una amplia gama de eficiencia y demanda en tiempo y recursos 19,20,21,22,23,24,25,26,27,28 . Hasta la fecha, ninguno de estos protocolos se ha aplicado para investigar cómo las células oligodendrogliales responden y afectan la patogénesis de la EA.

Aquí, describimos nuestros protocolos mejorados para cultivos únicos y mixtos de neuronas inducidas humanas (iNs) y OPC / oligodendrocitos (iOPC / iOL). El protocolo iN descrito aquí se basa en el enfoqueNgn2 16 ampliamente utilizado, y tiene la característica adicional de estar libre de glía. Los iNs resultantes son homogéneos y se asemejan mucho a las neuronas excitadoras de la capa cortical 2/3, con morfología piramidal característica, patrón de expresión génica y características electrofisiológicas17,18 (Figura 1). Para superar algunas de las barreras fundamentales en la diferenciación dirigida de células madre pluripotentes, hemos desarrollado un método simple y eficaz de pretratamiento con dosis bajas de dimetilsulfóxido (DMSO)29,30, y hemos reportado una mayor propensión de las células ES/iPS humanas a transdiferenciarse en iOPCs e iOLs31, basado en un protocolo ampliamente adaptado por Douvaras y Fossati 32 . Hemos simplificado aún más el protocolo e incorporado un compuesto robusto que promueve la diferenciación, clemastine 7,33,34, para acelerar el proceso de maduración oligodendroglial. Como resultado (Figura 2), las iOPC se pueden generar en 2 semanas (~95% positivo para el marcador O4) y las iOLs en cuatro semanas (expresando marcadores maduros MBP y PLP1). Curiosamente, encontramos que las iOPC solas secretan una cantidad notable de β amiloide (Aβ), consistente con los datos transcriptómicos independientes que muestran la abundante expresión de la proteína precursora amiloide (APP) y la proteasa de procesamiento β-secretasa (BACE1) en células de linaje oligodendrocitos35,36. Además, nuestro sistema de cocultivo iN-iOPC promueve el envoltorio de axones mediante procesos iOL positivos para MBP y proporciona un apoyo significativo para la formación de sinapsis (Figura 3). Por lo tanto, los protocolos que hemos detallado a continuación tienen ventajas técnicas y biológicas sobre los métodos de cocultivo neurona-oligodendroglia previamente catalogados, y prometen modelar mejor la neurodegeneración en la EA.

Protocol

1. Inducción de neuronas humanas a partir de células madre pluripotentes humanas Preparación de lentivirus (~ 5 días, protocolo detallado como se describió anteriormente16)Placa ~1 millón de células HEK293T cada matraz T75, para tenerlas ~40% confluentes al realizar la transfección. Transfectarlos con plásmidos que expresan Ngn2 inducible por tetraciclina y gen resistente a la puromicina (PuroR; bajo el mismo control del promotor TetO), rtTA y los tres plásmidos auxilia…

Representative Results

Generación directa de neuronas humanas inducidas a partir de células madre pluripotentes humanasEs muy importante que las células madre pluripotentes humanas iniciales exhiban un alto grado de pluripotencia para la generación exitosa de iNs o iOPCs/iOLs. Por lo tanto, las células deben teñirse para marcadores específicos, como Oct4 y SOX2, antes de iniciar cualquiera de los protocolos de inducción descritos en el presente manuscrito (Figura 1A). Se utilizaron cé…

Discussion

Además del apoyo físico y metabólico para estabilizar las estructuras sinapsis y facilitar la conducción de señales saltatorias por mielinización, las células del linaje de oligodendrocitos pueden dar forma al patrón de actividad neuronal a través de conversaciones cruzadas rápidas y dinámicas con las neuronas 5,6,7. Mientras que en la patología de la EA las respuestas oligodendrogliales se consideraron inicialmente …

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Este trabajo fue apoyado por las subvenciones de los Institutos Nacionales de Salud (R00 AG054616 a Y.A.H. y T32 GM136566 a K.C.), la Escuela de Medicina de la Universidad de Stanford y una beca Siebel (otorgada a SC). Y.A.H. es profesor traslacional de GFL del Centro de Neurociencia Traslacional del Instituto Brown de Ciencias Traslacionales.

Materials

Accutase STEMCELL Technologies 7920
B27 supplement ThermoFisher 17504044
bFGF ThermoFisher PHG 0266
cAMP MilliporeSigma A9501
Clemastine MilliporeSigma SML0445
DMEM/F12 medium STEMCELL Technologies 36254
DMSO ThermoFisher D12345
Doxycycline MilliporeSigma D3072
Fetal Bovine Serum ScienCell 10
H1 human ES cells WiCell WA01
Matrigel Corning 354234
mTeSR plus STEMCELL Technologies 5825
N2 supplement ThermoFisher 17502001
Neurobasal A medium ThermoFisher 10888-022
Non Essential Amino Acids ThermoFisher 11140-050
PDGF-AA R&D Systems 221-AA-010
PEI VWR 71002-812
pMDLg/pRRE Addgene 12251
Polybrene MilliporeSigma TR-1003-G
pRSV-REV Addgene 12253
Puromycin ThermoFisher A1113803
ROCK Inhibitor Y-27632 STEMCELL Technologies 72302
SAG Tocris 4366
STEMdiff Neural Progenitor Freezing Media STEMCELL Technologies 5838
STEMdiff SMADi Neural Induction Kit STEMCELL Technologies 8581
T3 triiodothyronine MilliporeSigma T6397
Tempo-iOlogo: Human iPSC-derived OPCs Tempo BioScience SKU102
TetO-Ng2-Puro Addgene 52047
VSV-G Addgene 12259

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Assetta, B., Tang, C., Bian, J., O’Rourke, R., Connolly, K., Brickler, T., Chetty, S., Huang, Y. A. Generation of Human Neurons and Oligodendrocytes from Pluripotent Stem Cells for Modeling Neuron-Oligodendrocyte Interactions. J. Vis. Exp. (165), e61778, doi:10.3791/61778 (2020).

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