Kombination von Multiplex-Fluoreszenz-In-situ-Hybridisierung mit fluoreszierender Immunhistochemie an frischen, gefrorenen oder fixierten Mäusehirnschnitten
Summary
Dieses Protokoll beschreibt eine Methode zur Kombination von Fluoreszenz-in-situ-Hybridisierung (FISH) und Fluoreszenz-Immunhistochemie (IHC) sowohl in frisch gefrorenen als auch in fixierten Maus-Hirnschnitten, mit dem Ziel, Multilabel-FISH und Fluoreszenz-IHC-Signal zu erreichen. IHC zielte auf zytoplasmatische und membrangebundene Proteine ab.
Abstract
Die Fluoreszenz-in-situ-Hybridisierung (FISH) ist eine molekulare Technik, die das Vorhandensein und die räumliche Verteilung spezifischer RNA-Transkripte in Zellen identifiziert. Die neurochemische Phänotypisierung von funktionell identifizierten Neuronen erfordert in der Regel die gleichzeitige Markierung mit mehreren Antikörpern (Targeting-Protein) mittels Immunhistochemie (IHC) und die Optimierung der In-situ-Hybridisierung (Targeting-RNA ). Eine “neurochemische Signatur” zur Charakterisierung bestimmter Neuronen kann erreicht werden, aber zu den erschwerenden Faktoren gehören die Notwendigkeit, FISH- und IHC-Ziele vor der Kombination der Methoden zu verifizieren, und die begrenzte Anzahl von RNAs und Proteinen, die gleichzeitig innerhalb desselben Gewebeschnitts anvisiert werden können.
Hier beschreiben wir ein Protokoll, das sowohl frisch gefrorene als auch fixierte Mäusegehirnpräparate verwendet, das mehrere mRNAs und Proteine im selben Gehirnschnitt mit RNAscope FISH und anschließender Fluoreszenz-Immunfärbung nachweist. Wir verwenden die kombinierte Methode, um das Expressionsmuster von mRNAs mit geringer Häufigkeit (z. B. Galaninrezeptor 1) und mRNAs mit hoher Häufigkeit (z. B. Glycintransporter 2) in immunhistochemisch identifizierten Hirnstammkernen zu beschreiben.
Die wichtigsten Überlegungen für die Proteinmarkierung nach dem FISH-Assay gehen über die Gewebevorbereitung und die Optimierung der FISH-Sondenmarkierung hinaus. Zum Beispiel haben wir herausgefunden, dass die Antikörperbindung und die Markierungsspezifität durch den Proteaseschritt innerhalb des FISH-Sonden-Assays nachteilig beeinflusst werden können. Proteasen katalysieren die hydrolytische Spaltung von Peptidbindungen und erleichtern so den Eintritt der FISH-Sonde in die Zellen, aber sie können auch das Protein verdauen, auf das der nachfolgende IHC-Assay abzielt, wodurch eine Off-Target-Bindung entsteht. Die subzelluläre Lokalisation des Zielproteins ist ein weiterer Faktor, der zum Erfolg der IHC nach dem FISH-Sondentest beiträgt. Wir beobachteten, dass die IHC-Spezifität erhalten blieb, wenn das Zielprotein membrangebunden ist, während IHC, das auf das zytoplasmatische Protein abzielte, eine umfangreiche Fehlerbehebung erforderte. Schließlich stellten wir fest, dass die Handhabung von fixiertem gefrorenem Gewebe auf Objektträgern schwieriger war als die von frischem gefrorenem Gewebe, jedoch war die IHC-Qualität mit fixiertem gefrorenem Gewebe in Kombination mit RNAscope insgesamt besser.
Introduction
Proteine und mRNAs, die neurochemisch Subpopulationen von Neuronen definieren, werden üblicherweise mit einer Kombination aus Immunhistochemie (IHC) und/oder In-situ-Hybridisierung (ISH) identifiziert. Die Kombination von ISH mit IHC-Techniken erleichtert die Charakterisierung von Kolokalisationsmustern, die für funktionelle Neuronen einzigartig sind (neurochemische Kodierung), indem die Multiplex-Markierungskapazität maximiert wird.
Fluoreszierende ISH (FISH)-Methoden, einschließlich RNAscope, haben eine höhere Sensitivität und Spezifität im Vergleich zu früheren RNA-Nachweismethoden wie radioaktivem ISH und nicht-radioaktivem chromogenem ISH. FISH ermöglicht die Visualisierung einzelner mRNA-Transkripte als punktgefärbte Spots1. Darüber hinaus ermöglicht der RNAscope-Assay die gleichzeitige Markierung einer größeren Anzahl von RNA-Zielen unter Verwendung verschiedener Fluorophor-Tags. Trotz dieser Vorteile können technische Einschränkungen die Anzahl der Fluorophore/Chromogene beeinflussen, die in einem einzigen Experiment verwendet werden können. Dazu gehören die Verfügbarkeit von Mikroskop-Filtersets; Solche Überlegungen werden noch verstärkt, wenn die neurochemische Identifizierung kombinierte FISH und IHC verwendet, verglichen mit der Verwendung beider Techniken allein, da inhärente Schritte, die für eine Methode optimal sind, für die andere nachteilig sein können.
Frühere Anwendungen von FISH in Kombination mit IHC haben die Expression spezifischer zellulärer Ziele in humanen B-Zell-Lymphomen2, Kükenembryonen3, Zebrafischembryonen4, Maus-Retina5 und Maus-Innenohrzellen6 gezeigt. In diesen Studien wurde das Gewebepräparat entweder in formalinfixiertes Paraffin eingebettet (FFPE)2,3,5 oder in frisches ganzesMount-4,6 eingelassen. In anderen Studien wurde chromogenes RNAscope auf fixierte Gehirnpräparate von Mäusen und Ratten angewendet 7,8,9. Insbesondere Baleriola et al.8 beschrieb zwei verschiedene Gewebepräparate für die kombinierte ISH-IHC; Korrigierte Maus-Gehirn-Schnitte und FFPE-Sektionen des menschlichen Gehirns. In einer kürzlich erschienenen Veröffentlichung haben wir FISH und fluoreszierende IHC auf frischen Gefrierschnitten kombiniert, um gleichzeitig mRNA mit geringer Häufigkeit (Galaninrezeptor 1, GalR1), mRNA mit hoher Häufigkeit (Glycintransporter 2, GlyT2) und vesikuläres Acetylcholintransporter (vAChT)-Protein10 in der retikulären Formation des Hirnstamms sichtbar zu machen.
Der Kern des Solitärtrakts (NTS) ist eine wichtige Hirnregion, die an der autonomen Funktion beteiligt ist. Diese heterogene Population von Neuronen befindet sich im Hinterhirn und empfängt und integriert eine große Anzahl autonomer Signale, einschließlich solcher, die die Atmung regulieren. Das NTS beherbergt mehrere neuronale Populationen, die phänotypisch durch das Expressionsmuster von mRNA-Zielen wie GalR1 und GlyT2 sowie Proteinmarker für das Enzym Tyrosinhydroxylase (TH) und den Transkriptionsfaktor Paired-like homeobox 2b (Phox2b) charakterisiert werden können.
Der RNAscope-Inhaber empfiehlt frische, gefrorene Gewebepräparate, aber Gewebe, das durch transkardiale Perfusionsfixierung bei Ganztieren hergestellt wurde, zusammen mit langfristiger Kryoprotektion (Lagerung bei -20 °C) von fixierten gefrorenen Gewebeschnitten, ist in vielen Labors üblich. Daher haben wir versucht, Protokolle für FISH in Kombination mit IHC unter Verwendung von frisch gefrorenen und fixierten gefrorenen Gewebepräparaten zu erstellen. Hier stellen wir für frisch gefrorene und fixierte gefrorene Hirnschnitte zur Verfügung: (1) ein Protokoll für kombinierte FISH und fluoreszierende IHC, (2) eine Beschreibung der Qualität der mRNA- und Proteinmarkierung, die bei Verwendung jedes Präparats erzeugt wird, (3) eine Beschreibung der Expression von GalR1 und GlyT2 im NTS.
Unsere Studie zeigte, dass in Kombination mit der RNAscope-Methodik der IHC-Erfolg in frisch gefrorenen und fixierten gefrorenen Präparaten variierte und von der Lokalisierung der Zielproteine in der Zelle abhing. In unseren Händen war die Markierung membrangebundener Proteine immer erfolgreich. Im Gegensatz dazu erforderte die IHC für zytoplasmatische Proteine eine Fehlerbehebung auch in Fällen, in denen das zytoplasmatische Protein in einem transgenen Tier überexprimiert wurde (Phox2b-GFP)11. Während GalR1 im NTS in nicht-katecholaminergen Neuronen exprimiert wird, fehlt die GlyT2-Expression im NTS.
Protocol
Representative Results
Discussion
In den Neurowissenschaften werden FISH und IHC routinemäßig eingesetzt, um die räumliche Organisation und funktionelle Bedeutung von mRNA oder Proteinen innerhalb neuronaler Subpopulationen zu untersuchen. Das in dieser Studie beschriebene Protokoll verbessert die Fähigkeit zum gleichzeitigen Nachweis von mRNAs und Proteinen in Hirnschnitten. Unser kombinierter Multiplex-FISH-IHC-Assay ermöglichte die phänotypische Identifizierung verschiedener neuronaler Subpopulationen im NTS sowohl in frisch gefrorenen als auch …
Acknowledgements
Diese Arbeit wurde durch das Australian Research Council Discovery Project Grant DP180101890 und das Rebecca L Cooper Medical Research Foundation Project Grant PG2018110 finanziert
Materials
| ANIMALS | |||
| C57BL/6 mouse | Australian BioResources, Moss Vale | MGI: 2159769 | |
| Phox2b-eGFP mouse | Australian BioResources, Moss Vale | MGI: 5776545 | |
| REAGENTS | |||
| Cyanoacrylate | Loctite | ||
| Ethylene Glycol | Sigma-Aldrich | 324558 | |
| Heparin-Sodium | Clifford Hallam Healthcare | 1070760 | Consult local veterinary supplier or pharmacy. |
| Lethabarb (Sodium Pentabarbitol) Euthanasia Injection | Virbac (Australia) Pty Ltd | N/A | Consult a veterinarian for local pharmaceutical regulations regarding Sodium Pentabarbitol |
| Molecular grade agarose powder | Sigma Aldrich | 5077 | |
| OCT Compound, 118mL | Scigen Ltd | 4586 | |
| Paraformaldehyde, prilled, 95% | Sigma-Aldrich | 441244-1KG | |
| Polyvinylpyrrolidone, average mol wt 40,000 (PVP-40) | Sigma-Aldrich | PVP40 | |
| ProLong Gold Antifade Mountant | Invitrogen | P36930 | With or without DAPI |
| RNAscope Multiplex Fluorescent Reagent Kit (up to 3-plex capability) | Advanced Cell Diagnostics, Inc. (ACD Bio) | ADV320850 | Includes 50x Wash buffer and Protease III |
| RNase Away | Thermo-Fisher Scientific | 7003 | |
| Tris(hydroxymethyl)aminomethane | Sigma-Aldrich | 252859 | |
| Tween-20, for molecular biology | Sigma-Aldrich | P9416 | |
| EQUIPMENT | |||
| Benchtop incubator | Thermoline scientific micro incubator | Model: TEI-13G | |
| Brain Matrix, Mouse, 30g Adult, Coronal, 1mm | Ted Pella | 15050 | |
| Cryostat | Leica | CM1950 | |
| Drawing-up needle (23 inch gauge) | BD | 0288U07 | |
| Hydrophobic Barrier Pen | Vector labs | H-4000 | |
| Kimtech Science Kimwipes Delicate Task Wipes | Kimberley Clark Professional | 34120 | |
| Olympus BX51 | Olympus | BX-51 | |
| Peristaltic pump | Coleparmer Masterflex | L/S Series | |
| Retiga 2000R Digital Camera | QImaging | RET-2000R-F-CLR | colour camera |
| SuperFrost Plus Glass Slides (White) | Thermo-Fisher Scientific | 4951PLUS4 | |
| Vibrating Microtome (Vibratome) | Leica | VT1200S | |
| Whatman qualitative filter paper, Grade 1, 110 mm diameter | Merck | WHA1001110 | |
| SOFTWARES | |||
| CorelDRAW | Corel Corporation | Version 7 | |
| FIJI (ImageJ Distribution) | Open Source/GNU General Public Licence (GPL) | N/A | ImageJ 2.x: Rueden, C. T.; Schindelin, J. & Hiner, M. C. et al. (2017), "ImageJ2: ImageJ for the next generation of scientific image data", BMC Bioinformatics 18:529, PMID 29187165, doi:10.1186/s12859-017-1934-z and Fiji: Schindelin, J.; Arganda-Carreras, I. & Frise, E. et al. (2012), "Fiji: an open-source platform for biological-image analysis", Nature methods 9(7): 676-682, PMID 22743772, doi:10.1038/nmeth.2019 |
| PRIMARY ANTIBODIES | |||
| Anti-Tyrosine Hydroxylase Antibody | Millipore Sigma | AB1542 | Sheep polyclonal (1:1000 dilution), RRID: AB_90755 |
| Anti-Tyrosine Hydroxylase Antibody, clone LNC1 | Millipore Sigma | MAB318 | Mouse monoclonal (1:1000 dilution), RRID: AB_2201528 |
| Anti-Vesicular Acetylcholine Transporter (VAchT) Antibody | Sigma-Aldrich | ABN100 | Goat polyclonal (1:1000 dilution), RRID: AB_2630394 |
| GFP Antibody | Novus Biologicals | NB600-308 | Rabbit polyclonal (1:1000 dilution), RRID: AB_10003058 |
| Phox2b Antibody (B-11) | Santa Cruz Biotechnology | sc-376997 | Mouse monoclonal (1:1000 dilution), RRID: AB_2813765 |
| SECONDARY ANTIBODIES | |||
| Alexa Fluor 488 AffiniPure Donkey Anti-Rabbit IgG (H+L) (min X Bov, Ck, Gt, GP, Sy Hms, Hrs, Hu, Ms, Rat, Shp Sr Prot) | Jackson ImmunoResearch | 711-545-152 | Donkey anti-Rabbit (1:400 dilution), RRID: AB_2313584 |
| AMCA AffiniPure Donkey Anti-Sheep IgG (H+L) (min X Ck, GP, Sy Hms, Hrs, Hu, Ms, Rb, Rat Sr Prot) | Jackson ImmunoResearch | 713-155-147 | Donkey anti-Sheep (1:400 dilution), RRID: AB_AB_2340725 |
| Cy5 AffiniPure Donkey Anti-Goat IgG (H+L) (min X Ck, GP, Sy Hms, Hrs, Hu, Ms, Rb, Rat Sr Prot) | Jackson ImmunoResearch | 705-175-147 | Donkey anti-Goat (1:400 dilution), RRID: AB_2340415 |
| Cy5 AffiniPure Donkey Anti-Mouse IgG (H+L) (min X Bov, Ck, Gt, GP, Sy Hms, Hrs, Hu, Rb, Rat, Shp Sr Prot) | Jackson ImmunoResearch | 715-175-151 | Donkey anti-Mouse (1:400 dilution), RRID: AB_2619678 |
| Cy5 AffiniPure Donkey Anti-Sheep IgG (H+L) (min X Ck, GP, Sy Hms, Hrs, Hu, Ms, Rb, Rat Sr Prot) | Jackson ImmunoResearch | 713-175-147 | Donkey anti-Sheep (1:400 dilution), RRID: AB_2340730 |
| RNASCOPE PROBES | |||
| Galanin Receptor 1 oligonucleotide probe | ACDBio | 448821-C1 | targets bp 482 – 1669 (Genebank ref: NM_008082.2) |
| Glycine transporter 2 oligonucleotide probe | ACDBio | 409741-C3 | targets bp 925 – 2153 (Genebank ref: NM_148931.3) |
| Phox2b oligonucleotide probe | ACDBio | 407861-C2 | targets bp 1617 – 2790 (Genebank ref: NM_008888.3) |
References
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