Bu protokol, çok etiketli FISH ve floresan IHC sinyali elde etmek amacıyla hem taze dondurulmuş hem de sabit fare beyin bölümlerinde floresan in situ hibridizasyon (FISH) ve floresan immünohistokimyasını (IHC) birleştirmek için bir yöntemi açıklar. IHC, sitoplazmik ve membrana bağlı proteinleri hedefledi.
Floresan in situ hibridizasyon (FISH), hücreler içindeki spesifik RNA transkriptlerinin varlığını ve uzamsal dağılımını tanımlayan moleküler bir tekniktir. Fonksiyonel olarak tanımlanmış nöronların nörokimyasal fenotiplemesi genellikle immünohistokimya (IHC) kullanılarak çoklu antikorlarla (hedefleme proteini) eşzamanlı etiketlemeyi ve in situ hibridizasyonun (RNA’yı hedefleme) birlikte optimizasyonunu gerektirir. Belirli nöronları karakterize etmek için bir “nörokimyasal imza” elde edilebilir, ancak karmaşık faktörler arasında, yöntemleri birleştirmeden önce FISH ve IHC hedeflerini doğrulama ihtiyacı ve aynı doku bölümü içinde aynı anda hedeflenebilecek sınırlı sayıda RNA ve protein bulunur.
Burada, hem taze dondurulmuş hem de sabit fare beyni preparatlarını kullanan, sırasıyla RNAscope FISH ve ardından floresan immün boyama kullanarak aynı beyin bölümündeki birden fazla mRNA’yı ve proteini tespit eden bir protokolü açıklıyoruz. İmmünohistokimyasal olarak tanımlanmış beyin sapı çekirdeklerinde düşük bolluklu mRNA’ların (örneğin, galanin reseptörü 1) ve yüksek bolluklu mRNA’ların (örneğin, glisin taşıyıcı 2) ekspresyon modelini tanımlamak için kombine yöntemi kullanıyoruz.
FISH tahlilinin çıkış yönündeki protein etiketlemesi için temel hususlar, doku hazırlığı ve FISH prob etiketlemesinin optimizasyonunun ötesine uzanır. Örneğin, antikor bağlanmasının ve etiketleme özgüllüğünün, FISH prob tahlili içindeki proteaz adımından zararlı bir şekilde etkilenebileceğini bulduk. Proteazlar, peptit bağlarının hidrolitik bölünmesini katalize ederek FISH probunun hücrelere girişini kolaylaştırır, ancak aynı zamanda sonraki IHC testi tarafından hedeflenen proteini sindirerek hedef bağlanma üretebilirler. Hedeflenen proteinin hücre altı yerleşimi, FISH prob testini takiben IHC başarısına katkıda bulunan bir başka faktördür. Hedeflenen protein membrana bağlandığında IHC özgüllüğünün korunduğunu gözlemledik, oysa IHC sitoplazmik proteini hedefleyen kapsamlı sorun giderme gerektirdi. Son olarak, slayta monte edilmiş sabit donmuş dokuların işlenmesinin taze donmuş dokudan daha zor olduğunu gördük, ancak IHC kalitesi, RNAscope ile birleştirildiğinde sabit donmuş doku ile genel olarak daha iyiydi.
Nöronların alt popülasyonlarını nörokimyasal olarak tanımlayan proteinler ve mRNA’lar genellikle sırasıyla immünohistokimya (IHC) ve/veya in situ hibridizasyon (ISH) kombinasyonu ile tanımlanır. ISH’nin IHC teknikleriyle birleştirilmesi, multipleks etiketleme kapasitesini en üst düzeye çıkararak fonksiyonel nöronlara özgü kolokalizasyon modellerinin karakterizasyonunu (nörokimyasal kodlama) kolaylaştırır.
RNAscope dahil olmak üzere floresan ISH (FISH) yöntemleri, radyoaktif ISH ve radyoaktif olmayan kromojenik ISH gibi önceki RNA tespit yöntemlerine kıyasla daha yüksek duyarlılık ve özgüllüğe sahiptir. FISH, tek mRNA transkriptlerinin noktasal lekeli noktalar olarak görselleştirilmesini sağlar1. Ayrıca, RNAscope testi, farklı florofor etiketleri kullanılarak bir seferde artan sayıda RNA hedefinin etiketlenmesine izin verir. Bu avantajlara rağmen, teknik sınırlamalar tek bir deneyde kullanılabilecek florofor/kromojen sayısını etkileyebilir. Bunlar arasında mikroskop filtre setlerinin mevcudiyeti; Bu tür düşünceler, nörokimyasal tanımlama, her bir tekniği ayrı ayrı kullanmaya kıyasla, kombine FISH ve IHC kullandığında, bir yöntem için en uygun doğal adımlar diğerine zarar verebileceğinden, daha da artar.
IHC ile kombine edilen FISH’in önceki uygulaması, insan B hücreli lenfomalarda2, civciv embriyolarında3, zebra balığı embriyolarında4, fare retina5 ve fare iç kulak hücrelerinde6 spesifik hücresel hedeflerin ekspresyonunu göstermiştir. Bu çalışmalarda, doku hazırlığı ya formalinle sabitlenmiş parafin gömülü (FFPE)2,3,5 ya da taze bütün montaj 4,6 idi. Diğer çalışmalar, sabit fare ve sıçan beyin preparatlarıüzerinde kromojenik RNAscope uyguladı 7,8,9. Özellikle, Baleriola ve ark.8 kombine ISH-IHC için iki farklı doku preparatı tanımladı; sabit fare beyni bölümleri ve FFPE insan beyni bölümleri. Yakın tarihli bir yayında, beyin sapı retiküler oluşumunda düşük bolluklu mRNA (galanin reseptörü 1, GalR1), yüksek bolluklu mRNA (glisin taşıyıcı 2, GlyT2) ve veziküler asetilkolin taşıyıcı (vAChT) proteini10’u aynı anda görselleştirmek için taze dondurulmuş bölümlerde FISH ve floresan IHC’yi birleştirdik.
Soliter sistemin (NTS) çekirdeği, otonomik fonksiyonda yer alan önemli bir beyin bölgesidir. Arka beyinde bulunan bu heterojen nöron popülasyonu, solunumu düzenleyenler de dahil olmak üzere çok sayıda otonomik sinyal alır ve entegre eder. NTS, GalR1 ve GlyT2 ve tirozin hidroksilaz (TH) enzimi için protein belirteçleri ve transkripsiyon faktörü Eşleştirilmiş benzeri homeobox 2b (Phox2b) dahil olmak üzere mRNA hedeflerinin ekspresyon modeli ile fenotipik olarak karakterize edilebilen birkaç nöronal popülasyonu barındırır.
RNAscope sahibi, taze donmuş doku preparatlarını önermektedir, ancak sabit donmuş doku bölümlerinin uzun süreli kriyoproteksiyonu (-20 ° C’de depolama) ile birlikte tüm hayvan transkardiyal perfüzyon fiksasyonu ile hazırlanan doku birçok laboratuvarda yaygındır. Bu nedenle, taze dondurulmuş ve sabit dondurulmuş doku preparatları kullanarak IHC ile kombinasyon halinde FISH için protokoller oluşturmaya çalıştık. Burada, taze dondurulmuş ve sabit donmuş beyin bölümleri sağlıyoruz: (1) kombine FISH ve floresan IHC için bir protokol (2) her preparat kullanılırken üretilen mRNA ve protein etiketlemesinin kalitesinin bir açıklaması (3) NTS’de GalR1 ve GlyT2 ekspresyonunun bir açıklaması.
Çalışmamız, RNAscope metodolojisi ile birleştirildiğinde, IHC başarısının taze dondurulmuş ve sabit dondurulmuş preparatlarda değiştiğini ve hedef proteinlerin hücre içindeki lokalizasyonuna bağlı olduğunu ortaya koymuştur. Bizim elimizde, membrana bağlı protein etiketlemesi her zaman başarılıydı. Buna karşılık, sitoplazmik protein için IHC, sitoplazmik proteinin transgenik bir hayvanda (Phox2b-GFP) aşırı eksprese edildiği durumlarda bile sorun gidermeyi gerektirdi11. Son olarak, NTS’de katekolaminerjik olmayan nöronlarda GalR1 eksprese edilirken, NTS’de GlyT2 ekspresyonu yoktur.
Sinirbilimde, FISH ve IHC, nöronal alt popülasyonlar içindeki mRNA veya proteinlerin uzamsal organizasyonunu ve işlevsel önemini araştırmak için rutin olarak kullanılır. Bu çalışmada açıklanan protokol, beyin bölümlerinde mRNA’ların ve proteinlerin aynı anda saptanması için kapasiteyi arttırır. Kombine multipleks FISH-IHC testimiz, hem taze dondurulmuş hem de sabit beyin preparatlarında NTS’deki farklı nöronal alt popülasyonların fenotipik olarak tanımlanmasını sağladı. Sabit donmuş dok…
Bu çalışma, Avustralya Araştırma Konseyi Keşif Projesi hibe DP180101890 ve Rebecca L Cooper Tıbbi Araştırma Vakfı proje hibe PG2018110
ANIMALS | |||
C57BL/6 mouse | Australian BioResources, Moss Vale | MGI: 2159769 | |
Phox2b-eGFP mouse | Australian BioResources, Moss Vale | MGI: 5776545 | |
REAGENTS | |||
Cyanoacrylate | Loctite | ||
Ethylene Glycol | Sigma-Aldrich | 324558 | |
Heparin-Sodium | Clifford Hallam Healthcare | 1070760 | Consult local veterinary supplier or pharmacy. |
Lethabarb (Sodium Pentabarbitol) Euthanasia Injection | Virbac (Australia) Pty Ltd | N/A | Consult a veterinarian for local pharmaceutical regulations regarding Sodium Pentabarbitol |
Molecular grade agarose powder | Sigma Aldrich | 5077 | |
OCT Compound, 118mL | Scigen Ltd | 4586 | |
Paraformaldehyde, prilled, 95% | Sigma-Aldrich | 441244-1KG | |
Polyvinylpyrrolidone, average mol wt 40,000 (PVP-40) | Sigma-Aldrich | PVP40 | |
ProLong Gold Antifade Mountant | Invitrogen | P36930 | With or without DAPI |
RNAscope Multiplex Fluorescent Reagent Kit (up to 3-plex capability) | Advanced Cell Diagnostics, Inc. (ACD Bio) | ADV320850 | Includes 50x Wash buffer and Protease III |
RNase Away | Thermo-Fisher Scientific | 7003 | |
Tris(hydroxymethyl)aminomethane | Sigma-Aldrich | 252859 | |
Tween-20, for molecular biology | Sigma-Aldrich | P9416 | |
EQUIPMENT | |||
Benchtop incubator | Thermoline scientific micro incubator | Model: TEI-13G | |
Brain Matrix, Mouse, 30g Adult, Coronal, 1mm | Ted Pella | 15050 | |
Cryostat | Leica | CM1950 | |
Drawing-up needle (23 inch gauge) | BD | 0288U07 | |
Hydrophobic Barrier Pen | Vector labs | H-4000 | |
Kimtech Science Kimwipes Delicate Task Wipes | Kimberley Clark Professional | 34120 | |
Olympus BX51 | Olympus | BX-51 | |
Peristaltic pump | Coleparmer Masterflex | L/S Series | |
Retiga 2000R Digital Camera | QImaging | RET-2000R-F-CLR | colour camera |
SuperFrost Plus Glass Slides (White) | Thermo-Fisher Scientific | 4951PLUS4 | |
Vibrating Microtome (Vibratome) | Leica | VT1200S | |
Whatman qualitative filter paper, Grade 1, 110 mm diameter | Merck | WHA1001110 | |
SOFTWARES | |||
CorelDRAW | Corel Corporation | Version 7 | |
FIJI (ImageJ Distribution) | Open Source/GNU General Public Licence (GPL) | N/A | ImageJ 2.x: Rueden, C. T.; Schindelin, J. & Hiner, M. C. et al. (2017), "ImageJ2: ImageJ for the next generation of scientific image data", BMC Bioinformatics 18:529, PMID 29187165, doi:10.1186/s12859-017-1934-z and Fiji: Schindelin, J.; Arganda-Carreras, I. & Frise, E. et al. (2012), "Fiji: an open-source platform for biological-image analysis", Nature methods 9(7): 676-682, PMID 22743772, doi:10.1038/nmeth.2019 |
PRIMARY ANTIBODIES | |||
Anti-Tyrosine Hydroxylase Antibody | Millipore Sigma | AB1542 | Sheep polyclonal (1:1000 dilution), RRID: AB_90755 |
Anti-Tyrosine Hydroxylase Antibody, clone LNC1 | Millipore Sigma | MAB318 | Mouse monoclonal (1:1000 dilution), RRID: AB_2201528 |
Anti-Vesicular Acetylcholine Transporter (VAchT) Antibody | Sigma-Aldrich | ABN100 | Goat polyclonal (1:1000 dilution), RRID: AB_2630394 |
GFP Antibody | Novus Biologicals | NB600-308 | Rabbit polyclonal (1:1000 dilution), RRID: AB_10003058 |
Phox2b Antibody (B-11) | Santa Cruz Biotechnology | sc-376997 | Mouse monoclonal (1:1000 dilution), RRID: AB_2813765 |
SECONDARY ANTIBODIES | |||
Alexa Fluor 488 AffiniPure Donkey Anti-Rabbit IgG (H+L) (min X Bov, Ck, Gt, GP, Sy Hms, Hrs, Hu, Ms, Rat, Shp Sr Prot) | Jackson ImmunoResearch | 711-545-152 | Donkey anti-Rabbit (1:400 dilution), RRID: AB_2313584 |
AMCA AffiniPure Donkey Anti-Sheep IgG (H+L) (min X Ck, GP, Sy Hms, Hrs, Hu, Ms, Rb, Rat Sr Prot) | Jackson ImmunoResearch | 713-155-147 | Donkey anti-Sheep (1:400 dilution), RRID: AB_AB_2340725 |
Cy5 AffiniPure Donkey Anti-Goat IgG (H+L) (min X Ck, GP, Sy Hms, Hrs, Hu, Ms, Rb, Rat Sr Prot) | Jackson ImmunoResearch | 705-175-147 | Donkey anti-Goat (1:400 dilution), RRID: AB_2340415 |
Cy5 AffiniPure Donkey Anti-Mouse IgG (H+L) (min X Bov, Ck, Gt, GP, Sy Hms, Hrs, Hu, Rb, Rat, Shp Sr Prot) | Jackson ImmunoResearch | 715-175-151 | Donkey anti-Mouse (1:400 dilution), RRID: AB_2619678 |
Cy5 AffiniPure Donkey Anti-Sheep IgG (H+L) (min X Ck, GP, Sy Hms, Hrs, Hu, Ms, Rb, Rat Sr Prot) | Jackson ImmunoResearch | 713-175-147 | Donkey anti-Sheep (1:400 dilution), RRID: AB_2340730 |
RNASCOPE PROBES | |||
Galanin Receptor 1 oligonucleotide probe | ACDBio | 448821-C1 | targets bp 482 – 1669 (Genebank ref: NM_008082.2) |
Glycine transporter 2 oligonucleotide probe | ACDBio | 409741-C3 | targets bp 925 – 2153 (Genebank ref: NM_148931.3) |
Phox2b oligonucleotide probe | ACDBio | 407861-C2 | targets bp 1617 – 2790 (Genebank ref: NM_008888.3) |