Summary

Multipleks Floresan In Situ Hibridizasyonun Floresan İmmünohistokimya ile Taze Dondurulmuş veya Sabit Fare Beyin Kesitlerinde Birleştirilmesi

Published: June 25, 2021
doi:

Summary

Bu protokol, çok etiketli FISH ve floresan IHC sinyali elde etmek amacıyla hem taze dondurulmuş hem de sabit fare beyin bölümlerinde floresan in situ hibridizasyon (FISH) ve floresan immünohistokimyasını (IHC) birleştirmek için bir yöntemi açıklar. IHC, sitoplazmik ve membrana bağlı proteinleri hedefledi.

Abstract

Floresan in situ hibridizasyon (FISH), hücreler içindeki spesifik RNA transkriptlerinin varlığını ve uzamsal dağılımını tanımlayan moleküler bir tekniktir. Fonksiyonel olarak tanımlanmış nöronların nörokimyasal fenotiplemesi genellikle immünohistokimya (IHC) kullanılarak çoklu antikorlarla (hedefleme proteini) eşzamanlı etiketlemeyi ve in situ hibridizasyonun (RNA’yı hedefleme) birlikte optimizasyonunu gerektirir. Belirli nöronları karakterize etmek için bir “nörokimyasal imza” elde edilebilir, ancak karmaşık faktörler arasında, yöntemleri birleştirmeden önce FISH ve IHC hedeflerini doğrulama ihtiyacı ve aynı doku bölümü içinde aynı anda hedeflenebilecek sınırlı sayıda RNA ve protein bulunur.

Burada, hem taze dondurulmuş hem de sabit fare beyni preparatlarını kullanan, sırasıyla RNAscope FISH ve ardından floresan immün boyama kullanarak aynı beyin bölümündeki birden fazla mRNA’yı ve proteini tespit eden bir protokolü açıklıyoruz. İmmünohistokimyasal olarak tanımlanmış beyin sapı çekirdeklerinde düşük bolluklu mRNA’ların (örneğin, galanin reseptörü 1) ve yüksek bolluklu mRNA’ların (örneğin, glisin taşıyıcı 2) ekspresyon modelini tanımlamak için kombine yöntemi kullanıyoruz.

FISH tahlilinin çıkış yönündeki protein etiketlemesi için temel hususlar, doku hazırlığı ve FISH prob etiketlemesinin optimizasyonunun ötesine uzanır. Örneğin, antikor bağlanmasının ve etiketleme özgüllüğünün, FISH prob tahlili içindeki proteaz adımından zararlı bir şekilde etkilenebileceğini bulduk. Proteazlar, peptit bağlarının hidrolitik bölünmesini katalize ederek FISH probunun hücrelere girişini kolaylaştırır, ancak aynı zamanda sonraki IHC testi tarafından hedeflenen proteini sindirerek hedef bağlanma üretebilirler. Hedeflenen proteinin hücre altı yerleşimi, FISH prob testini takiben IHC başarısına katkıda bulunan bir başka faktördür. Hedeflenen protein membrana bağlandığında IHC özgüllüğünün korunduğunu gözlemledik, oysa IHC sitoplazmik proteini hedefleyen kapsamlı sorun giderme gerektirdi. Son olarak, slayta monte edilmiş sabit donmuş dokuların işlenmesinin taze donmuş dokudan daha zor olduğunu gördük, ancak IHC kalitesi, RNAscope ile birleştirildiğinde sabit donmuş doku ile genel olarak daha iyiydi.

Introduction

Nöronların alt popülasyonlarını nörokimyasal olarak tanımlayan proteinler ve mRNA’lar genellikle sırasıyla immünohistokimya (IHC) ve/veya in situ hibridizasyon (ISH) kombinasyonu ile tanımlanır. ISH’nin IHC teknikleriyle birleştirilmesi, multipleks etiketleme kapasitesini en üst düzeye çıkararak fonksiyonel nöronlara özgü kolokalizasyon modellerinin karakterizasyonunu (nörokimyasal kodlama) kolaylaştırır.

RNAscope dahil olmak üzere floresan ISH (FISH) yöntemleri, radyoaktif ISH ve radyoaktif olmayan kromojenik ISH gibi önceki RNA tespit yöntemlerine kıyasla daha yüksek duyarlılık ve özgüllüğe sahiptir. FISH, tek mRNA transkriptlerinin noktasal lekeli noktalar olarak görselleştirilmesini sağlar1. Ayrıca, RNAscope testi, farklı florofor etiketleri kullanılarak bir seferde artan sayıda RNA hedefinin etiketlenmesine izin verir. Bu avantajlara rağmen, teknik sınırlamalar tek bir deneyde kullanılabilecek florofor/kromojen sayısını etkileyebilir. Bunlar arasında mikroskop filtre setlerinin mevcudiyeti; Bu tür düşünceler, nörokimyasal tanımlama, her bir tekniği ayrı ayrı kullanmaya kıyasla, kombine FISH ve IHC kullandığında, bir yöntem için en uygun doğal adımlar diğerine zarar verebileceğinden, daha da artar.

IHC ile kombine edilen FISH’in önceki uygulaması, insan B hücreli lenfomalarda2, civciv embriyolarında3, zebra balığı embriyolarında4, fare retina5 ve fare iç kulak hücrelerinde6 spesifik hücresel hedeflerin ekspresyonunu göstermiştir. Bu çalışmalarda, doku hazırlığı ya formalinle sabitlenmiş parafin gömülü (FFPE)2,3,5 ya da taze bütün montaj 4,6 idi. Diğer çalışmalar, sabit fare ve sıçan beyin preparatlarıüzerinde kromojenik RNAscope uyguladı 7,8,9. Özellikle, Baleriola ve ark.8 kombine ISH-IHC için iki farklı doku preparatı tanımladı; sabit fare beyni bölümleri ve FFPE insan beyni bölümleri. Yakın tarihli bir yayında, beyin sapı retiküler oluşumunda düşük bolluklu mRNA (galanin reseptörü 1, GalR1), yüksek bolluklu mRNA (glisin taşıyıcı 2, GlyT2) ve veziküler asetilkolin taşıyıcı (vAChT) proteini10’u aynı anda görselleştirmek için taze dondurulmuş bölümlerde FISH ve floresan IHC’yi birleştirdik.

Soliter sistemin (NTS) çekirdeği, otonomik fonksiyonda yer alan önemli bir beyin bölgesidir. Arka beyinde bulunan bu heterojen nöron popülasyonu, solunumu düzenleyenler de dahil olmak üzere çok sayıda otonomik sinyal alır ve entegre eder. NTS, GalR1 ve GlyT2 ve tirozin hidroksilaz (TH) enzimi için protein belirteçleri ve transkripsiyon faktörü Eşleştirilmiş benzeri homeobox 2b (Phox2b) dahil olmak üzere mRNA hedeflerinin ekspresyon modeli ile fenotipik olarak karakterize edilebilen birkaç nöronal popülasyonu barındırır.

RNAscope sahibi, taze donmuş doku preparatlarını önermektedir, ancak sabit donmuş doku bölümlerinin uzun süreli kriyoproteksiyonu (-20 ° C’de depolama) ile birlikte tüm hayvan transkardiyal perfüzyon fiksasyonu ile hazırlanan doku birçok laboratuvarda yaygındır. Bu nedenle, taze dondurulmuş ve sabit dondurulmuş doku preparatları kullanarak IHC ile kombinasyon halinde FISH için protokoller oluşturmaya çalıştık. Burada, taze dondurulmuş ve sabit donmuş beyin bölümleri sağlıyoruz: (1) kombine FISH ve floresan IHC için bir protokol (2) her preparat kullanılırken üretilen mRNA ve protein etiketlemesinin kalitesinin bir açıklaması (3) NTS’de GalR1 ve GlyT2 ekspresyonunun bir açıklaması.

Çalışmamız, RNAscope metodolojisi ile birleştirildiğinde, IHC başarısının taze dondurulmuş ve sabit dondurulmuş preparatlarda değiştiğini ve hedef proteinlerin hücre içindeki lokalizasyonuna bağlı olduğunu ortaya koymuştur. Bizim elimizde, membrana bağlı protein etiketlemesi her zaman başarılıydı. Buna karşılık, sitoplazmik protein için IHC, sitoplazmik proteinin transgenik bir hayvanda (Phox2b-GFP) aşırı eksprese edildiği durumlarda bile sorun gidermeyi gerektirdi11. Son olarak, NTS’de katekolaminerjik olmayan nöronlarda GalR1 eksprese edilirken, NTS’de GlyT2 ekspresyonu yoktur.

Protocol

Doku ön işleme adımlarının bir özeti Şekil 1’de bulunabilir. Tüm prosedürler, New South Wales Üniversitesi Hayvan Bakımı ve Etik Kurulu’na uygun olarak, hayvanların bilimsel amaçlarla kullanımı ve bakımı için yönergelere (Avustralya Ulusal Sağlık ve Tıbbi Araştırma Konseyi) uygun olarak gerçekleştirilmiştir. 1. Taze donmuş beyin dokusunun örnek hazırlanması Transkardiyal PerfüzyonHeparinize (2500 U/L) 0.1 M fosfat…

Representative Results

Burada, fare NTS’sinde sırasıyla taze dondurulmuş ve paraformaldehit sabit dokuları kullanarak GalR1 ve GlyT2 için mRNA ekspresyonunu lokalize etmek için multipleks FISH’i floresan IHC ile birleştirmek için bir yöntemi özetliyoruz. Yöntemlerde açıklanan doku işleme, FISH ve IHC prosedürlerinin bir boru hattı Şekil 1 ve Şekil 2’de gösterilmektedir. Tablo 1 , her şekilde kullanılan FISH probu ve antikor kombinasyonlarının bi…

Discussion

Sinirbilimde, FISH ve IHC, nöronal alt popülasyonlar içindeki mRNA veya proteinlerin uzamsal organizasyonunu ve işlevsel önemini araştırmak için rutin olarak kullanılır. Bu çalışmada açıklanan protokol, beyin bölümlerinde mRNA’ların ve proteinlerin aynı anda saptanması için kapasiteyi arttırır. Kombine multipleks FISH-IHC testimiz, hem taze dondurulmuş hem de sabit beyin preparatlarında NTS’deki farklı nöronal alt popülasyonların fenotipik olarak tanımlanmasını sağladı. Sabit donmuş dok…

Acknowledgements

Bu çalışma, Avustralya Araştırma Konseyi Keşif Projesi hibe DP180101890 ve Rebecca L Cooper Tıbbi Araştırma Vakfı proje hibe PG2018110

Materials

ANIMALS
C57BL/6 mouse Australian BioResources, Moss Vale MGI: 2159769
Phox2b-eGFP mouse Australian BioResources, Moss Vale MGI: 5776545
REAGENTS
Cyanoacrylate Loctite
Ethylene Glycol Sigma-Aldrich 324558
Heparin-Sodium Clifford Hallam Healthcare 1070760 Consult local veterinary supplier or pharmacy.
Lethabarb (Sodium Pentabarbitol) Euthanasia Injection Virbac (Australia) Pty Ltd N/A Consult a veterinarian for local pharmaceutical regulations regarding Sodium Pentabarbitol
Molecular grade agarose powder Sigma Aldrich 5077
OCT Compound, 118mL Scigen Ltd 4586
Paraformaldehyde, prilled, 95% Sigma-Aldrich 441244-1KG
Polyvinylpyrrolidone, average mol wt 40,000  (PVP-40) Sigma-Aldrich PVP40
ProLong Gold Antifade Mountant Invitrogen P36930 With or without DAPI
RNAscope Multiplex Fluorescent Reagent Kit (up to 3-plex capability) Advanced Cell Diagnostics, Inc. (ACD Bio) ADV320850 Includes 50x Wash buffer and Protease III
RNase Away Thermo-Fisher Scientific 7003
Tris(hydroxymethyl)aminomethane Sigma-Aldrich 252859
Tween-20, for molecular biology Sigma-Aldrich P9416
EQUIPMENT
Benchtop incubator Thermoline scientific micro incubator Model: TEI-13G
Brain Matrix, Mouse, 30g Adult, Coronal, 1mm Ted Pella 15050
Cryostat Leica CM1950
Drawing-up needle (23 inch gauge) BD 0288U07
Hydrophobic Barrier Pen Vector labs H-4000
Kimtech Science Kimwipes Delicate Task Wipes Kimberley Clark Professional 34120
Olympus BX51 Olympus BX-51
Peristaltic pump Coleparmer Masterflex L/S Series 
Retiga 2000R Digital Camera QImaging RET-2000R-F-CLR colour camera
SuperFrost Plus Glass Slides (White) Thermo-Fisher Scientific 4951PLUS4
Vibrating Microtome (Vibratome) Leica VT1200S
Whatman qualitative filter paper, Grade 1, 110 mm diameter Merck WHA1001110
SOFTWARES
CorelDRAW  Corel Corporation Version 7
FIJI (ImageJ Distribution) Open Source/GNU General Public Licence (GPL) N/A ImageJ 2.x: Rueden, C. T.; Schindelin, J. & Hiner, M. C. et al. (2017), "ImageJ2: ImageJ for the next generation of scientific image data", BMC Bioinformatics 18:529, PMID 29187165, doi:10.1186/s12859-017-1934-z   and Fiji: Schindelin, J.; Arganda-Carreras, I. & Frise, E. et al. (2012), "Fiji: an open-source platform for biological-image analysis", Nature methods 9(7): 676-682, PMID 22743772, doi:10.1038/nmeth.2019 
PRIMARY ANTIBODIES
Anti-Tyrosine Hydroxylase Antibody Millipore Sigma AB1542 Sheep polyclonal (1:1000 dilution), RRID: AB_90755
Anti-Tyrosine Hydroxylase Antibody, clone LNC1 Millipore Sigma MAB318 Mouse monoclonal (1:1000 dilution), RRID: AB_2201528
Anti-Vesicular Acetylcholine Transporter (VAchT) Antibody Sigma-Aldrich ABN100 Goat polyclonal (1:1000 dilution), RRID: AB_2630394
GFP Antibody Novus Biologicals NB600-308 Rabbit polyclonal (1:1000 dilution), RRID: AB_10003058
Phox2b Antibody (B-11) Santa Cruz Biotechnology sc-376997 Mouse monoclonal (1:1000 dilution), RRID: AB_2813765
SECONDARY ANTIBODIES
Alexa Fluor 488 AffiniPure Donkey Anti-Rabbit IgG (H+L) (min X Bov, Ck, Gt, GP, Sy Hms, Hrs, Hu, Ms, Rat, Shp Sr Prot)  Jackson ImmunoResearch 711-545-152 Donkey anti-Rabbit (1:400 dilution), RRID: AB_2313584
AMCA AffiniPure Donkey Anti-Sheep IgG (H+L) (min X Ck, GP, Sy Hms, Hrs, Hu, Ms, Rb, Rat Sr Prot) Jackson ImmunoResearch 713-155-147 Donkey anti-Sheep (1:400 dilution), RRID: AB_AB_2340725
Cy5 AffiniPure Donkey Anti-Goat IgG (H+L) (min X Ck, GP, Sy Hms, Hrs, Hu, Ms, Rb, Rat Sr Prot) Jackson ImmunoResearch 705-175-147 Donkey anti-Goat (1:400 dilution), RRID: AB_2340415
Cy5 AffiniPure Donkey Anti-Mouse IgG (H+L) (min X Bov, Ck, Gt, GP, Sy Hms, Hrs, Hu, Rb, Rat, Shp Sr Prot) Jackson ImmunoResearch 715-175-151 Donkey anti-Mouse (1:400 dilution), RRID: AB_2619678
Cy5 AffiniPure Donkey Anti-Sheep IgG (H+L) (min X Ck, GP, Sy Hms, Hrs, Hu, Ms, Rb, Rat Sr Prot) Jackson ImmunoResearch 713-175-147 Donkey anti-Sheep (1:400 dilution), RRID: AB_2340730
RNASCOPE PROBES
Galanin Receptor 1 oligonucleotide probe ACDBio 448821-C1 targets bp 482 – 1669 (Genebank ref: NM_008082.2)
Glycine transporter 2 oligonucleotide probe ACDBio 409741-C3 targets bp 925 – 2153 (Genebank ref: NM_148931.3)
Phox2b oligonucleotide probe ACDBio 407861-C2 targets bp 1617 – 2790 (Genebank ref: NM_008888.3)

References

  1. Wang, F., et al. RNAscope: a novel in situ RNA analysis platform for formalin-fixed, paraffin-embedded tissues. Journal of Molecular Diagnostics. 14 (1), 22-29 (2012).
  2. Annese, T., et al. RNAscope dual ISH-IHC technology to study angiogenesis in diffuse large B-cell lymphomas. Histochemistry and Cell Biology. 153 (3), 185-192 (2020).
  3. Morrison, J. A., McKinney, M. C., Kulesa, P. M. Resolving in vivo gene expression during collective cell migration using an integrated RNAscope, immunohistochemistry and tissue clearing method. Mechanisms of Development. 148, 100-106 (2017).
  4. Gross-Thebing, T., Paksa, A., Raz, E. Simultaneous high-resolution detection of multiple transcripts combined with localization of proteins in whole-mount embryos. BMC Biology. 12, 55 (2014).
  5. Stempel, A. J., Morgans, C. W., Stout, J. T., Appukuttan, B. Simultaneous visualization and cell-specific confirmation of RNA and protein in the mouse retina. Molecular Vision. 20, 1366-1373 (2014).
  6. Kersigo, J., et al. A RNAscope whole mount approach that can be combined with immunofluorescence to quantify differential distribution of mRNA. Cell and Tissue Research. 374 (2), 251-262 (2018).
  7. Grabinski, T. M., Kneynsberg, A., Manfredsson, F. P., Kanaan, N. M. A method for combining RNAscope in situ hybridization with immunohistochemistry in thick free-floating brain sections and primary neuronal cultures. PLoS One. 10 (3), 0120120 (2015).
  8. Baleriola, J., Jean, Y., Troy, C., Hengst, U. Detection of axonally localized mRNAs in brain sections using high-resolution in situ hybridization. Journal of Visualized Experiments. (100), e52799 (2015).
  9. Fe Lanfranco, M., Loane, D. J., Mocchetti, I., Burns, M. P., Villapol, S. Combination of fluorescent in situ hybridization (FISH) and immunofluorescence imaging for detection of cytokine expression in microglia/macrophage cells. Bio-Protocol. 7 (22), (2017).
  10. Dereli, A. S., Yaseen, Z., Carrive, P., Kumar, N. N. Adaptation of respiratory-related brain regions to long-term hypercapnia: focus on neuropeptides in the RTN. Frontiers in Neuroscience. 13, 1343 (2019).
  11. Lazarenko, R. M., et al. Acid sensitivity and ultrastructure of the retrotrapezoid nucleus in Phox2b-EGFP transgenic mice. Journal of Comparative Neurology. 517 (1), 69-86 (2009).
  12. Gage, G. J., Kipke, D. R., Shain, W. Whole animal perfusion fixation for rodents. Journal of Visualized Experiments. (65), e3564 (2012).
  13. Paxinos, G., Franklin, K. B. . The mouse brain in stereotaxic coordinates. , (2004).
  14. Abercrombie, M. Estimation of nuclear population from microtome sections. Anatomical Records. 94, 239-247 (1946).
  15. Kerr, N., et al. The generation of knock-in mice expressing fluorescently tagged galanin receptors 1 and 2. Molecular and Cellular Neurosciences. 68, 258-271 (2015).
  16. Kachidian, P., Pickel, V. M. Localization of tyrosine hydroxylase in neuronal targets and efferents of the area postrema in the nucleus tractus solitarii of the rat. Journal of Comparative Neurology. 329 (3), 337-353 (1993).
  17. Stornetta, R. L., et al. Expression of Phox2b by brainstem neurons involved in chemosensory integration in the adult rat. Journal of Neuroscience. 26 (40), 10305-10314 (2006).
  18. Gilmor, M. L., et al. Expression of the putative vesicular acetylcholine transporter in rat brain and localization in cholinergic synaptic vesicles. Journal of Neuroscience. 16 (7), 2179-2190 (1996).
  19. Fisher, J. M., Sossin, W., Newcomb, R., Scheller, R. H. Multiple neuropeptides derived from a common precursor are differentially packaged and transported. Cell. 54 (6), 813-822 (1988).
  20. Towle, A. C., Lauder, J. M., Joh, T. H. Optimization of tyrosine-hydroxylase immunocytochemistry in paraffin sections using pretreatment with proteolytic-enzymes. Journal of Histochemistry and Cytochemistry. 32 (7), 766-770 (1984).
  21. Biancardi, V., et al. Mapping of the excitatory, inhibitory, and modulatory afferent projections to the anatomically defined active expiratory oscillator in adult male rats. Journal of Comparative Neurology. 529 (4), 853-884 (2021).
  22. Matthews, D. W., et al. Feedback in the brainstem: an excitatory disynaptic pathway for control of whisking. Journal of Comparative Neurology. 523 (6), 921-942 (2015).
  23. Ramos-Vara, J. A. Principles and methods of immunohistochemistry. Methods in Molecular Biology. 1641, 115-128 (2017).
  24. Shi, S. R., Key, M. E., Kalra, K. L. Antigen retrieval in formalin-fixed, paraffin-embedded tissues: an enhancement method for immunohistochemical staining based on microwave oven heating of tissue sections. Journal of Histochemistry and Cytochemistry. 39 (6), 741-748 (1991).
  25. Yamashita, S., Katsumata, O. Heat-induced antigen retrieval in immunohistochemistry: mechanisms and applications. Methods in Molecular Biology. 1560, 147-161 (2017).
  26. Yamashita, S., Okada, Y. Mechanisms of heat-induced antigen retrieval: analyses in vitro employing SDS-PAGE and immunohistochemistry. Journal of Histochemistry and Cytochemistry. 53 (1), 13-21 (2005).
  27. Yamashita, S. Heat-induced antigen retrieval: mechanisms and application to histochemistry. Progress in Histochemistry and Cytochemistry. 41 (3), 141-200 (2007).

Play Video

Cite This Article
Dereli, A. S., Bailey, E. J., Kumar, N. N. Combining Multiplex Fluorescence In Situ Hybridization with Fluorescent Immunohistochemistry on Fresh Frozen or Fixed Mouse Brain Sections. J. Vis. Exp. (172), e61709, doi:10.3791/61709 (2021).

View Video