Combinatie van multiplex fluorescentie in situ hybridisatie met fluorescerende immunohistochemie op vers ingevroren of vaste hersensecties van muizen
Summary
Dit protocol beschrijft een methode voor het combineren van fluorescentie in situ hybridisatie (FISH) en fluorescentie immunohistochemie (IHC) in zowel vers ingevroren als gefixeerde hersensecties van muizen, met als doel het bereiken van multilabel FISH en fluorescentie IHC-signaal. IHC richtte zich op cytoplasmatische en membraangebonden eiwitten.
Abstract
Fluorescerende in situ hybridisatie (FISH) is een moleculaire techniek die de aanwezigheid en ruimtelijke verdeling van specifieke RNA-transcripten in cellen identificeert. Neurochemische fenotypering van functioneel geïdentificeerde neuronen vereist meestal gelijktijdige labeling met meerdere antilichamen (gericht op eiwit) met behulp van immunohistochemie (IHC) en optimalisatie van in situ hybridisatie (gericht op RNA), in tandem. Een “neurochemische handtekening” om bepaalde neuronen te karakteriseren kan worden bereikt, maar complicerende factoren zijn onder meer de noodzaak om FISH- en IHC-doelen te verifiëren voordat de methoden worden gecombineerd, en het beperkte aantal RNA’s en eiwitten dat tegelijkertijd binnen dezelfde weefselsectie kan worden aangevallen.
Hier beschrijven we een protocol, met behulp van zowel vers ingevroren als vaste muizenhersenpreparaten, dat meerdere mRNA’s en eiwitten in hetzelfde hersengedeelte detecteert met behulp van RNAscope FISH, gevolgd door respectievelijk fluorescentie-immunokleuring. We gebruiken de gecombineerde methode om het expressiepatroon van mRNA’s met een lage abundantie (bijv. galaninereceptor 1) en mRNA’s met een hoge abundantie (bijv. glycinetransporter 2) te beschrijven in immunohistochemisch geïdentificeerde hersenstamkernen.
De belangrijkste overwegingen voor eiwitetikettering stroomafwaarts van de FISH-test gaan verder dan weefselvoorbereiding en optimalisatie van de etikettering van de FISH-sonde. We ontdekten bijvoorbeeld dat de binding van antilichamen en de specificiteit van de etikettering nadelig kunnen worden beïnvloed door de proteasestap binnen de FISH-sondetest. Proteasen katalyseren hydrolytische splitsing van peptidebindingen, waardoor het binnendringen van de FISH-sonde in cellen wordt vergemakkelijkt, maar ze kunnen ook het eiwit verteren waarop de daaropvolgende IHC-test zich richt, waardoor off-target binding ontstaat. De subcellulaire locatie van het beoogde eiwit is een andere factor die bijdraagt aan het succes van IHC na de FISH-sondetest. We zagen dat IHC-specificiteit behouden bleef wanneer het beoogde eiwit membraangebonden is, terwijl IHC-gericht op cytoplasmatisch eiwit uitgebreide probleemoplossing vereiste. Ten slotte vonden we het hanteren van op objectglaasjes gemonteerd vast bevroren weefsel een grotere uitdaging dan vers ingevroren weefsel, maar de IHC-kwaliteit was over het algemeen beter met vast bevroren weefsel, in combinatie met RNAscope.
Introduction
Eiwitten en mRNA’s die neurochemisch subpopulaties van neuronen definiëren, worden gewoonlijk geïdentificeerd met een combinatie van respectievelijk immunohistochemie (IHC) en/of in situ hybridisatie (ISH). Het combineren van ISH met IHC-technieken vergemakkelijkt de karakterisering van colokalisatiepatronen die uniek zijn voor functionele neuronen (neurochemische codering) door de multiplex-labelcapaciteit te maximaliseren.
Fluorescerende ISH (FISH)-methoden, waaronder RNAscope, hebben een hogere gevoeligheid en specificiteit in vergelijking met eerdere RNA-detectiemethoden zoals radioactief ISH en niet-radioactief chromogeen ISH. FISH maakt visualisatie mogelijk van enkelvoudige mRNA-transcripten als puntvormige gekleurde vlekken1. Bovendien maakt de RNAscope-assay het mogelijk om een groter aantal RNA-doelen tegelijk te labelen, met behulp van verschillende fluorofoortags. Ondanks deze voordelen kunnen technische beperkingen van invloed zijn op het aantal fluoroforen/chromogenen dat in een enkel experiment kan worden gebruikt. Deze omvatten de beschikbaarheid van microscoopfiltersets; dergelijke overwegingen worden nog verergerd wanneer neurochemische identificatie gebruik maakt van gecombineerde FISH en IHC, in vergelijking met het gebruik van elke techniek afzonderlijk, aangezien inherente stappen die optimaal zijn voor de ene methode schadelijk kunnen zijn voor de andere.
Eerdere toepassing van FISH in combinatie met IHC heeft de expressie van specifieke cellulaire doelwitten aangetoond in menselijke B-cellymfomen2, kuikenembryo’s3, zebravisembryo’s4, muizennetvlies5 en binnenoorcellen van muizen6. In deze onderzoeken was de weefselvoorbereiding ofwel in formaline gefixeerde paraffine ingebed (FFPE)2,3,5 ofwel verse hele montage 4,6. Andere studies pasten chromogene RNAscope toe op vaste preparaten van muizen en rattenhersenen 7,8,9. In het bijzonder Baleriola et al.8 beschreef twee verschillende weefselpreparaten voor gecombineerde ISH-IHC; vaste hersensecties van muizen en FFPE-hersensecties van mensen. In een recente publicatie combineerden we FISH en fluorescerende IHC op vers ingevroren secties, om tegelijkertijd mRNA met een lage abundantie (galaninereceptor 1, GalR1), mRNA met een hoge abundantie (glycinetransporter 2, GlyT2) en vesiculaire acetylcholinetransporter (vAChT) proteïne10 in de reticulaire formatie van de hersenstam te visualiseren.
De kern van het solitaire kanaal (NTS) is een belangrijk hersengebied dat betrokken is bij de autonome functie. Deze heterogene populatie van neuronen bevindt zich in de achterhersenen en ontvangt en integreert een groot aantal autonome signalen, waaronder signalen die de ademhaling reguleren. De NTS herbergt verschillende neuronale populaties, die fenotypisch kunnen worden gekenmerkt door het expressiepatroon van mRNA-doelen, waaronder GalR1 en GlyT2 en eiwitmarkers voor het enzym tyrosinehydroxylase (TH) en de transcriptiefactor Paired-like homeobox 2b (Phox2b).
De eigenaar van RNAscope beveelt vers ingevroren weefselpreparaten aan, maar weefsel dat is voorbereid door transcardiale perfusiefixatie van hele dieren, samen met cryoprotectie op lange termijn (opslag bij -20 °C) van vaste ingevroren weefselsecties, is gebruikelijk in veel laboratoria. Daarom hebben we geprobeerd protocollen op te stellen voor FISH in combinatie met IHC met behulp van vers ingevroren en gefixeerde ingevroren weefselpreparaten. Hier voorzien we in vers ingevroren en gefixeerde ingevroren hersensecties: (1) een protocol voor gecombineerde FISH en fluorescerende IHC (2) een beschrijving van de kwaliteit van de geproduceerde mRNA- en eiwitetikettering bij gebruik van elk preparaat (3) een beschrijving van de expressie van GalR1 en GlyT2 in de NTS.
Onze studie toonde aan dat, in combinatie met RNAscope-methodologie, het IHC-succes varieerde in vers ingevroren en gefixeerde diepvriespreparaten en afhankelijk was van lokalisatie van de doeleiwitten in de cel. In onze handen was het labelen van membraangebonden eiwitten altijd succesvol. IHC voor cytoplasmatisch eiwit daarentegen vereiste probleemoplossing, zelfs in gevallen waarin het cytoplasmatische eiwit tot overexpressie werd gebracht in een transgeen dier (Phox2b-GFP)11. Ten slotte, terwijl GalR1 tot expressie wordt gebracht in niet-catecholaminerge neuronen in de NTS, is GlyT2-expressie afwezig in de NTS.
Protocol
Representative Results
Discussion
In de neurowetenschappen worden FISH en IHC routinematig gebruikt om de ruimtelijke organisatie en functionele betekenis van mRNA of eiwitten binnen neuronale subpopulaties te onderzoeken. Het protocol dat in deze studie wordt beschreven, vergroot de capaciteit voor gelijktijdige detectie van mRNA’s en eiwitten in hersensecties. Onze gecombineerde multiplex FISH-IHC-test maakte fenotypische identificatie mogelijk van verschillende neuronale subpopulaties in de NTS in zowel vers ingevroren als gefixeerde hersenpreparaten….
Acknowledgements
Dit werk werd gefinancierd door de Australian Research Council Discovery Project-subsidie DP180101890 en Rebecca L Cooper Medical Research Foundation-projectsubsidie PG2018110
Materials
| ANIMALS | |||
| C57BL/6 mouse | Australian BioResources, Moss Vale | MGI: 2159769 | |
| Phox2b-eGFP mouse | Australian BioResources, Moss Vale | MGI: 5776545 | |
| REAGENTS | |||
| Cyanoacrylate | Loctite | ||
| Ethylene Glycol | Sigma-Aldrich | 324558 | |
| Heparin-Sodium | Clifford Hallam Healthcare | 1070760 | Consult local veterinary supplier or pharmacy. |
| Lethabarb (Sodium Pentabarbitol) Euthanasia Injection | Virbac (Australia) Pty Ltd | N/A | Consult a veterinarian for local pharmaceutical regulations regarding Sodium Pentabarbitol |
| Molecular grade agarose powder | Sigma Aldrich | 5077 | |
| OCT Compound, 118mL | Scigen Ltd | 4586 | |
| Paraformaldehyde, prilled, 95% | Sigma-Aldrich | 441244-1KG | |
| Polyvinylpyrrolidone, average mol wt 40,000 (PVP-40) | Sigma-Aldrich | PVP40 | |
| ProLong Gold Antifade Mountant | Invitrogen | P36930 | With or without DAPI |
| RNAscope Multiplex Fluorescent Reagent Kit (up to 3-plex capability) | Advanced Cell Diagnostics, Inc. (ACD Bio) | ADV320850 | Includes 50x Wash buffer and Protease III |
| RNase Away | Thermo-Fisher Scientific | 7003 | |
| Tris(hydroxymethyl)aminomethane | Sigma-Aldrich | 252859 | |
| Tween-20, for molecular biology | Sigma-Aldrich | P9416 | |
| EQUIPMENT | |||
| Benchtop incubator | Thermoline scientific micro incubator | Model: TEI-13G | |
| Brain Matrix, Mouse, 30g Adult, Coronal, 1mm | Ted Pella | 15050 | |
| Cryostat | Leica | CM1950 | |
| Drawing-up needle (23 inch gauge) | BD | 0288U07 | |
| Hydrophobic Barrier Pen | Vector labs | H-4000 | |
| Kimtech Science Kimwipes Delicate Task Wipes | Kimberley Clark Professional | 34120 | |
| Olympus BX51 | Olympus | BX-51 | |
| Peristaltic pump | Coleparmer Masterflex | L/S Series | |
| Retiga 2000R Digital Camera | QImaging | RET-2000R-F-CLR | colour camera |
| SuperFrost Plus Glass Slides (White) | Thermo-Fisher Scientific | 4951PLUS4 | |
| Vibrating Microtome (Vibratome) | Leica | VT1200S | |
| Whatman qualitative filter paper, Grade 1, 110 mm diameter | Merck | WHA1001110 | |
| SOFTWARES | |||
| CorelDRAW | Corel Corporation | Version 7 | |
| FIJI (ImageJ Distribution) | Open Source/GNU General Public Licence (GPL) | N/A | ImageJ 2.x: Rueden, C. T.; Schindelin, J. & Hiner, M. C. et al. (2017), "ImageJ2: ImageJ for the next generation of scientific image data", BMC Bioinformatics 18:529, PMID 29187165, doi:10.1186/s12859-017-1934-z and Fiji: Schindelin, J.; Arganda-Carreras, I. & Frise, E. et al. (2012), "Fiji: an open-source platform for biological-image analysis", Nature methods 9(7): 676-682, PMID 22743772, doi:10.1038/nmeth.2019 |
| PRIMARY ANTIBODIES | |||
| Anti-Tyrosine Hydroxylase Antibody | Millipore Sigma | AB1542 | Sheep polyclonal (1:1000 dilution), RRID: AB_90755 |
| Anti-Tyrosine Hydroxylase Antibody, clone LNC1 | Millipore Sigma | MAB318 | Mouse monoclonal (1:1000 dilution), RRID: AB_2201528 |
| Anti-Vesicular Acetylcholine Transporter (VAchT) Antibody | Sigma-Aldrich | ABN100 | Goat polyclonal (1:1000 dilution), RRID: AB_2630394 |
| GFP Antibody | Novus Biologicals | NB600-308 | Rabbit polyclonal (1:1000 dilution), RRID: AB_10003058 |
| Phox2b Antibody (B-11) | Santa Cruz Biotechnology | sc-376997 | Mouse monoclonal (1:1000 dilution), RRID: AB_2813765 |
| SECONDARY ANTIBODIES | |||
| Alexa Fluor 488 AffiniPure Donkey Anti-Rabbit IgG (H+L) (min X Bov, Ck, Gt, GP, Sy Hms, Hrs, Hu, Ms, Rat, Shp Sr Prot) | Jackson ImmunoResearch | 711-545-152 | Donkey anti-Rabbit (1:400 dilution), RRID: AB_2313584 |
| AMCA AffiniPure Donkey Anti-Sheep IgG (H+L) (min X Ck, GP, Sy Hms, Hrs, Hu, Ms, Rb, Rat Sr Prot) | Jackson ImmunoResearch | 713-155-147 | Donkey anti-Sheep (1:400 dilution), RRID: AB_AB_2340725 |
| Cy5 AffiniPure Donkey Anti-Goat IgG (H+L) (min X Ck, GP, Sy Hms, Hrs, Hu, Ms, Rb, Rat Sr Prot) | Jackson ImmunoResearch | 705-175-147 | Donkey anti-Goat (1:400 dilution), RRID: AB_2340415 |
| Cy5 AffiniPure Donkey Anti-Mouse IgG (H+L) (min X Bov, Ck, Gt, GP, Sy Hms, Hrs, Hu, Rb, Rat, Shp Sr Prot) | Jackson ImmunoResearch | 715-175-151 | Donkey anti-Mouse (1:400 dilution), RRID: AB_2619678 |
| Cy5 AffiniPure Donkey Anti-Sheep IgG (H+L) (min X Ck, GP, Sy Hms, Hrs, Hu, Ms, Rb, Rat Sr Prot) | Jackson ImmunoResearch | 713-175-147 | Donkey anti-Sheep (1:400 dilution), RRID: AB_2340730 |
| RNASCOPE PROBES | |||
| Galanin Receptor 1 oligonucleotide probe | ACDBio | 448821-C1 | targets bp 482 – 1669 (Genebank ref: NM_008082.2) |
| Glycine transporter 2 oligonucleotide probe | ACDBio | 409741-C3 | targets bp 925 – 2153 (Genebank ref: NM_148931.3) |
| Phox2b oligonucleotide probe | ACDBio | 407861-C2 | targets bp 1617 – 2790 (Genebank ref: NM_008888.3) |
References
- Wang, F., et al. RNAscope: a novel in situ RNA analysis platform for formalin-fixed, paraffin-embedded tissues. Journal of Molecular Diagnostics. 14 (1), 22-29 (2012).
- Annese, T., et al. RNAscope dual ISH-IHC technology to study angiogenesis in diffuse large B-cell lymphomas. Histochemistry and Cell Biology. 153 (3), 185-192 (2020).
- Morrison, J. A., McKinney, M. C., Kulesa, P. M. Resolving in vivo gene expression during collective cell migration using an integrated RNAscope, immunohistochemistry and tissue clearing method. Mechanisms of Development. 148, 100-106 (2017).
- Gross-Thebing, T., Paksa, A., Raz, E. Simultaneous high-resolution detection of multiple transcripts combined with localization of proteins in whole-mount embryos. BMC Biology. 12, 55 (2014).
- Stempel, A. J., Morgans, C. W., Stout, J. T., Appukuttan, B. Simultaneous visualization and cell-specific confirmation of RNA and protein in the mouse retina. Molecular Vision. 20, 1366-1373 (2014).
- Kersigo, J., et al. A RNAscope whole mount approach that can be combined with immunofluorescence to quantify differential distribution of mRNA. Cell and Tissue Research. 374 (2), 251-262 (2018).
- Grabinski, T. M., Kneynsberg, A., Manfredsson, F. P., Kanaan, N. M. A method for combining RNAscope in situ hybridization with immunohistochemistry in thick free-floating brain sections and primary neuronal cultures. PLoS One. 10 (3), 0120120 (2015).
- Baleriola, J., Jean, Y., Troy, C., Hengst, U. Detection of axonally localized mRNAs in brain sections using high-resolution in situ hybridization. Journal of Visualized Experiments. (100), e52799 (2015).
- Fe Lanfranco, M., Loane, D. J., Mocchetti, I., Burns, M. P., Villapol, S. Combination of fluorescent in situ hybridization (FISH) and immunofluorescence imaging for detection of cytokine expression in microglia/macrophage cells. Bio-Protocol. 7 (22), (2017).
- Dereli, A. S., Yaseen, Z., Carrive, P., Kumar, N. N. Adaptation of respiratory-related brain regions to long-term hypercapnia: focus on neuropeptides in the RTN. Frontiers in Neuroscience. 13, 1343 (2019).
- Lazarenko, R. M., et al. Acid sensitivity and ultrastructure of the retrotrapezoid nucleus in Phox2b-EGFP transgenic mice. Journal of Comparative Neurology. 517 (1), 69-86 (2009).
- Gage, G. J., Kipke, D. R., Shain, W. Whole animal perfusion fixation for rodents. Journal of Visualized Experiments. (65), e3564 (2012).
- Paxinos, G., Franklin, K. B. . The mouse brain in stereotaxic coordinates. , (2004).
- Abercrombie, M. Estimation of nuclear population from microtome sections. Anatomical Records. 94, 239-247 (1946).
- Kerr, N., et al. The generation of knock-in mice expressing fluorescently tagged galanin receptors 1 and 2. Molecular and Cellular Neurosciences. 68, 258-271 (2015).
- Kachidian, P., Pickel, V. M. Localization of tyrosine hydroxylase in neuronal targets and efferents of the area postrema in the nucleus tractus solitarii of the rat. Journal of Comparative Neurology. 329 (3), 337-353 (1993).
- Stornetta, R. L., et al. Expression of Phox2b by brainstem neurons involved in chemosensory integration in the adult rat. Journal of Neuroscience. 26 (40), 10305-10314 (2006).
- Gilmor, M. L., et al. Expression of the putative vesicular acetylcholine transporter in rat brain and localization in cholinergic synaptic vesicles. Journal of Neuroscience. 16 (7), 2179-2190 (1996).
- Fisher, J. M., Sossin, W., Newcomb, R., Scheller, R. H. Multiple neuropeptides derived from a common precursor are differentially packaged and transported. Cell. 54 (6), 813-822 (1988).
- Towle, A. C., Lauder, J. M., Joh, T. H. Optimization of tyrosine-hydroxylase immunocytochemistry in paraffin sections using pretreatment with proteolytic-enzymes. Journal of Histochemistry and Cytochemistry. 32 (7), 766-770 (1984).
- Biancardi, V., et al. Mapping of the excitatory, inhibitory, and modulatory afferent projections to the anatomically defined active expiratory oscillator in adult male rats. Journal of Comparative Neurology. 529 (4), 853-884 (2021).
- Matthews, D. W., et al. Feedback in the brainstem: an excitatory disynaptic pathway for control of whisking. Journal of Comparative Neurology. 523 (6), 921-942 (2015).
- Ramos-Vara, J. A. Principles and methods of immunohistochemistry. Methods in Molecular Biology. 1641, 115-128 (2017).
- Shi, S. R., Key, M. E., Kalra, K. L. Antigen retrieval in formalin-fixed, paraffin-embedded tissues: an enhancement method for immunohistochemical staining based on microwave oven heating of tissue sections. Journal of Histochemistry and Cytochemistry. 39 (6), 741-748 (1991).
- Yamashita, S., Katsumata, O. Heat-induced antigen retrieval in immunohistochemistry: mechanisms and applications. Methods in Molecular Biology. 1560, 147-161 (2017).
- Yamashita, S., Okada, Y. Mechanisms of heat-induced antigen retrieval: analyses in vitro employing SDS-PAGE and immunohistochemistry. Journal of Histochemistry and Cytochemistry. 53 (1), 13-21 (2005).
- Yamashita, S. Heat-induced antigen retrieval: mechanisms and application to histochemistry. Progress in Histochemistry and Cytochemistry. 41 (3), 141-200 (2007).
