マルチプレックス蛍光 In Situ ハイブリダイゼーションと蛍光免疫組織化学の融合による新鮮、凍結、または固定マウスの脳切片の結合(英語)
Summary
このプロトコルはmultilabel FISHおよび蛍光性のIHC信号を達成することを目標に、新しい凍結および固定マウス頭脳セクションの蛍光性in situ の交配(魚)および蛍光性のimmunohistochemistry (IHC)を、結合するための方法を記述する。IHCは細胞質および膜結合タンパク質を標的としました。
Abstract
蛍光 in situ ハイブリダイゼーション(FISH)は、細胞内の特定のRNA転写物の存在と空間分布を同定する分子技術です。機能的に同定されたニューロンの神経化学的表現型決定には、通常、免疫組織化学(IHC)を用いた複数の抗体(標的タンパク質)による同時標識と、 in situ ハイブリダイゼーション(標的RNA)の最適化が必要です。特定のニューロンを特徴づける「神経化学的特徴」は達成される可能性がありますが、複雑な要因には、方法を組み合わせる前にFISHとIHCの標的を検証する必要があること、および同じ組織切片内で同時に標的とする可能性のあるRNAとタンパク質の数が限られていることが含まれます。
ここでは、新鮮な凍結マウス脳調製物と固定マウス脳調製物の両方を使用して、RNAscope FISHとそれに続く蛍光免疫染色を使用して、同じ脳切片内の複数のmRNAとタンパク質をそれぞれ検出するプロトコルについて説明します。免疫組織化学的に同定された脳幹核において、少量のmRNA(ガラニン受容体1など)と高存在量のmRNA(グリシントランスポーター2など)の発現パターンを記述するために、組み合わせた方法を使用します。
FISHアッセイの下流におけるタンパク質ラベリングに関する重要な考慮事項は、組織調製やFISHプローブラベリングの最適化にとどまりません。例えば、抗体の結合と標識の特異性は、FISHプローブアッセイ内のプロテアーゼステップによって悪影響を受ける可能性があることがわかりました。プロテアーゼは、ペプチド結合の加水分解による切断を触媒し、FISHプローブの細胞内への侵入を促進しますが、その後のIHCアッセイで標的とされたタンパク質を消化し、オフターゲット結合を生じさせる可能性もあります。標的タンパク質の細胞内位置も、FISHプローブアッセイ後のIHCの成功に寄与する要因です。標的タンパク質が膜結合している場合、IHC特異性は維持されるのに対し、細胞質タンパク質を標的とするIHCには広範なトラブルシューティングが必要であることが観察されました。最後に、スライドマウントされた固定凍結組織の取り扱いは、新鮮な凍結組織よりも難しいことがわかりましたが、RNAscopeと組み合わせると、固定凍結組織のIHC品質が全体的に向上しました。
Introduction
ニューロンの亜集団を神経化学的に定義するタンパク質およびmRNAは、通常、免疫組織化学(IHC)および/または in situ ハイブリダイゼーション(ISH)の組み合わせでそれぞれ同定されます。ISHとIHC技術を組み合わせることで、マルチプレックス標識能力を最大化することにより、機能性ニューロンに特有の共局在パターンの特性評価(神経化学的コーディング)が容易になります。
RNAscopeを含む蛍光ISH(FISH)法は、放射性ISHや非放射性発色性ISHなどの以前のRNA検出法と比較して、より高い感度と特異性を備えています。FISHは、単一のmRNA転写産物を点状染色スポットとして可視化することができます1。さらに、RNAscopeアッセイでは、異なる蛍光色素タグを用いて、一度により多くのRNAターゲットを標識することができます。これらの利点にもかかわらず、技術的な制限により、1回の実験で使用できる蛍光色素/発色剤の数に影響を与える可能性があります。これらには、顕微鏡フィルターセットの可用性が含まれます。神経化学的同定でFISHとIHCを組み合わせて使用する場合、一方の方法に最適な固有のステップが他方の方法に悪影響を与える可能性があるため、各手法を単独で使用する場合と比較して、このような考慮事項は複雑になります。
IHCと組み合わせたFISHの以前の適用では、ヒトB細胞リンパ腫2、ニワトリ胚3、ゼブラフィッシュ胚4、マウス網膜5、およびマウス内耳細胞6で特異的な細胞標的の発現が実証されています。これらの研究では、組織調製はホルマリン固定パラフィン包埋(FFPE)2,3,5または新鮮なホールマウント4,6のいずれかでした。他の研究では、固定されたマウスおよびラットの脳調製物に発色RNAスコープを適用しました7,8,9。特に、Baleriola et al.図8には、ISH-IHCを組み合わせた2つの異なる組織調製物が記載されていた。マウスの脳のセクションとFFPEのヒトの脳のセクションを修正しました。最近の論文では、FISHと蛍光IHCを新鮮凍結切片で組み合わせ、脳幹網様体中の低存在量mRNA(ガラニン受容体1、GalR1)、高存在量mRNA(グリシントランスポーター2、GlyT2)、小胞性アセチルコリントランスポーター(vAChT)タンパク質10を同時に可視化しました。
孤立路核(NTS)は、自律神経機能に関与する主要な脳領域です。後脳に位置するこの不均一なニューロン集団は、呼吸を調節するものを含む膨大な数の自律神経信号を受信して統合します。NTSはいくつかのニューロン集団を有しており、GalR1およびGlyT2を含むmRNA標的の発現パターン、および酵素チロシンヒドロキシラーゼ(TH)および転写因子ペア様ホメオボックス2b(Phox2b)のタンパク質マーカーによって表現型的に特徴付けられる可能性がある。
RNAscopeの所有者は、新鮮な凍結組織調製物を推奨していますが、固定凍結組織切片の長期凍結保護(-20°Cでの保存)とともに、全動物経心灌流固定によって調製された組織は、多くの研究室で一般的です。そこで、新鮮凍結および固定凍結組織調製物を用いたIHCと組み合わせたFISHのプロトコールの確立を目指しました。ここでは、新鮮な凍結および固定凍結された脳切片を提供します:(1)FISHと蛍光IHCを組み合わせたプロトコル、(2)各調製物を利用する場合に生成されるmRNAおよびタンパク質標識の品質の説明、(3)NTSにおけるGalR1およびGlyT2の発現の説明。
私たちの研究は、RNAscopeの方法論と組み合わせた場合、IHCの成功は、新鮮な凍結製剤と固定凍結製剤で異なり、細胞内の標的タンパク質の局在に依存することが明らかになりました。私たちの手では、膜結合タンパク質のラベリングは常に成功していました。対照的に、細胞質タンパク質のIHCは、トランスジェニック動物(Phox2b-GFP)で細胞質タンパク質が過剰発現している場合でもトラブルシューティングが必要でした11。最後に、GalR1はNTSの非カテコールアミン作動性ニューロンで発現しているが、GlyT2の発現はNTSでは存在しない。
Protocol
Representative Results
Discussion
神経科学では、FISHとIHCは、ニューロン亜集団内のmRNAまたはタンパク質の空間的構成と機能的意義を調査するために日常的に使用されています。この研究で記述されているプロトコルは頭脳セクションのmRNAsそして蛋白質の同時検出のための容量を高める。マルチプレックスFISH-IHCアッセイの組み合わせにより、新鮮な凍結脳製剤と固定脳製剤の両方において、NTSの異なるニューロン亜集団の?…
Acknowledgements
この研究は、オーストラリア研究評議会のディスカバリープロジェクト助成金DP180101890およびレベッカLクーパー医学研究財団プロジェクト助成金PG2018110によって資金提供されました
Materials
| ANIMALS | |||
| C57BL/6 mouse | Australian BioResources, Moss Vale | MGI: 2159769 | |
| Phox2b-eGFP mouse | Australian BioResources, Moss Vale | MGI: 5776545 | |
| REAGENTS | |||
| Cyanoacrylate | Loctite | ||
| Ethylene Glycol | Sigma-Aldrich | 324558 | |
| Heparin-Sodium | Clifford Hallam Healthcare | 1070760 | Consult local veterinary supplier or pharmacy. |
| Lethabarb (Sodium Pentabarbitol) Euthanasia Injection | Virbac (Australia) Pty Ltd | N/A | Consult a veterinarian for local pharmaceutical regulations regarding Sodium Pentabarbitol |
| Molecular grade agarose powder | Sigma Aldrich | 5077 | |
| OCT Compound, 118mL | Scigen Ltd | 4586 | |
| Paraformaldehyde, prilled, 95% | Sigma-Aldrich | 441244-1KG | |
| Polyvinylpyrrolidone, average mol wt 40,000 (PVP-40) | Sigma-Aldrich | PVP40 | |
| ProLong Gold Antifade Mountant | Invitrogen | P36930 | With or without DAPI |
| RNAscope Multiplex Fluorescent Reagent Kit (up to 3-plex capability) | Advanced Cell Diagnostics, Inc. (ACD Bio) | ADV320850 | Includes 50x Wash buffer and Protease III |
| RNase Away | Thermo-Fisher Scientific | 7003 | |
| Tris(hydroxymethyl)aminomethane | Sigma-Aldrich | 252859 | |
| Tween-20, for molecular biology | Sigma-Aldrich | P9416 | |
| EQUIPMENT | |||
| Benchtop incubator | Thermoline scientific micro incubator | Model: TEI-13G | |
| Brain Matrix, Mouse, 30g Adult, Coronal, 1mm | Ted Pella | 15050 | |
| Cryostat | Leica | CM1950 | |
| Drawing-up needle (23 inch gauge) | BD | 0288U07 | |
| Hydrophobic Barrier Pen | Vector labs | H-4000 | |
| Kimtech Science Kimwipes Delicate Task Wipes | Kimberley Clark Professional | 34120 | |
| Olympus BX51 | Olympus | BX-51 | |
| Peristaltic pump | Coleparmer Masterflex | L/S Series | |
| Retiga 2000R Digital Camera | QImaging | RET-2000R-F-CLR | colour camera |
| SuperFrost Plus Glass Slides (White) | Thermo-Fisher Scientific | 4951PLUS4 | |
| Vibrating Microtome (Vibratome) | Leica | VT1200S | |
| Whatman qualitative filter paper, Grade 1, 110 mm diameter | Merck | WHA1001110 | |
| SOFTWARES | |||
| CorelDRAW | Corel Corporation | Version 7 | |
| FIJI (ImageJ Distribution) | Open Source/GNU General Public Licence (GPL) | N/A | ImageJ 2.x: Rueden, C. T.; Schindelin, J. & Hiner, M. C. et al. (2017), "ImageJ2: ImageJ for the next generation of scientific image data", BMC Bioinformatics 18:529, PMID 29187165, doi:10.1186/s12859-017-1934-z and Fiji: Schindelin, J.; Arganda-Carreras, I. & Frise, E. et al. (2012), "Fiji: an open-source platform for biological-image analysis", Nature methods 9(7): 676-682, PMID 22743772, doi:10.1038/nmeth.2019 |
| PRIMARY ANTIBODIES | |||
| Anti-Tyrosine Hydroxylase Antibody | Millipore Sigma | AB1542 | Sheep polyclonal (1:1000 dilution), RRID: AB_90755 |
| Anti-Tyrosine Hydroxylase Antibody, clone LNC1 | Millipore Sigma | MAB318 | Mouse monoclonal (1:1000 dilution), RRID: AB_2201528 |
| Anti-Vesicular Acetylcholine Transporter (VAchT) Antibody | Sigma-Aldrich | ABN100 | Goat polyclonal (1:1000 dilution), RRID: AB_2630394 |
| GFP Antibody | Novus Biologicals | NB600-308 | Rabbit polyclonal (1:1000 dilution), RRID: AB_10003058 |
| Phox2b Antibody (B-11) | Santa Cruz Biotechnology | sc-376997 | Mouse monoclonal (1:1000 dilution), RRID: AB_2813765 |
| SECONDARY ANTIBODIES | |||
| Alexa Fluor 488 AffiniPure Donkey Anti-Rabbit IgG (H+L) (min X Bov, Ck, Gt, GP, Sy Hms, Hrs, Hu, Ms, Rat, Shp Sr Prot) | Jackson ImmunoResearch | 711-545-152 | Donkey anti-Rabbit (1:400 dilution), RRID: AB_2313584 |
| AMCA AffiniPure Donkey Anti-Sheep IgG (H+L) (min X Ck, GP, Sy Hms, Hrs, Hu, Ms, Rb, Rat Sr Prot) | Jackson ImmunoResearch | 713-155-147 | Donkey anti-Sheep (1:400 dilution), RRID: AB_AB_2340725 |
| Cy5 AffiniPure Donkey Anti-Goat IgG (H+L) (min X Ck, GP, Sy Hms, Hrs, Hu, Ms, Rb, Rat Sr Prot) | Jackson ImmunoResearch | 705-175-147 | Donkey anti-Goat (1:400 dilution), RRID: AB_2340415 |
| Cy5 AffiniPure Donkey Anti-Mouse IgG (H+L) (min X Bov, Ck, Gt, GP, Sy Hms, Hrs, Hu, Rb, Rat, Shp Sr Prot) | Jackson ImmunoResearch | 715-175-151 | Donkey anti-Mouse (1:400 dilution), RRID: AB_2619678 |
| Cy5 AffiniPure Donkey Anti-Sheep IgG (H+L) (min X Ck, GP, Sy Hms, Hrs, Hu, Ms, Rb, Rat Sr Prot) | Jackson ImmunoResearch | 713-175-147 | Donkey anti-Sheep (1:400 dilution), RRID: AB_2340730 |
| RNASCOPE PROBES | |||
| Galanin Receptor 1 oligonucleotide probe | ACDBio | 448821-C1 | targets bp 482 – 1669 (Genebank ref: NM_008082.2) |
| Glycine transporter 2 oligonucleotide probe | ACDBio | 409741-C3 | targets bp 925 – 2153 (Genebank ref: NM_148931.3) |
| Phox2b oligonucleotide probe | ACDBio | 407861-C2 | targets bp 1617 – 2790 (Genebank ref: NM_008888.3) |
References
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