שילוב של הכלאה פלואורסצנטית באתרו עם אימונוהיסטוכימיה פלואורסצנטית על חלקי מוח טריים של עכברים קפואים או קבועים
Summary
פרוטוקול זה מתאר שיטה לשילוב הכלאה פלואורסצנטית באתרו (FISH) ואימונוהיסטוכימיה פלואורסצנטית (IHC) באזורי מוח עכבר טריים קפואים וקבועים, במטרה להשיג FISH רב-תוויות ואות IHC פלואורסצנטי. IHC התמקד בחלבונים ציטופלזמיים וחלבונים המחוברים לממברנה.
Abstract
הכלאה פלואורסצנטית באתרו (באנגלית: Fluorescent in situ hybridization, בקיצור FISH) היא טכניקה מולקולרית המזהה נוכחות והתפלגות מרחבית של תעתיקי רנ”א ספציפיים בתוך תאים. פנוטיפ נוירוכימי של נוירונים המזוהים פונקציונלית דורש בדרך כלל תיוג מקביל עם נוגדנים מרובים (חלבון מטרה) באמצעות אימונוהיסטוכימיה (IHC) ואופטימיזציה של הכלאה באתרו (RNA ממוקד), במקביל. ניתן להשיג “חתימה נוירוכימית” כדי לאפיין נוירונים מסוימים, אולם גורמים מסובכים כוללים את הצורך לאמת מטרות FISH ו-IHC לפני שילוב השיטות, והמספר המוגבל של רנ”א וחלבונים שניתן לכוון בו זמנית באותו מקטע רקמה.
כאן אנו מתארים פרוטוקול, המשתמש הן בתכשירים טריים קפואים והן בתכשירי מוח קבועים של עכברים, אשר מזהה מספר mRNA וחלבונים באותו אזור במוח באמצעות RNAscope FISH ואחריו פלואורסצנטיות immunostaining, בהתאמה. אנו משתמשים בשיטה המשולבת כדי לתאר את דפוס הביטוי של mRNA בשפע נמוך (למשל, קולטן גלנין 1) ו-mRNA בשפע גבוה (למשל, טרנספורטר גליצין 2), בגרעיני גזע המוח המזוהים אימונוהיסטוכימית.
שיקולים מרכזיים לסימון חלבונים במורד הזרם של בדיקת FISH מתרחבים מעבר להכנת רקמות ואופטימיזציה של תיוג בדיקת FISH. לדוגמה, מצאנו כי קשירת נוגדנים וספציפיות התיוג יכולים להיות מושפעים לרעה על ידי שלב פרוטאז בתוך בדיקת FISH. פרוטאזות מזרזות פיצול הידרוליטי של קשרים פפטידיים, ומקלות על כניסת גשושיות FISH לתאים, אולם הן עשויות גם לעכל את החלבון הממוקד על ידי בדיקת IHC שלאחר מכן, ולייצר קשירת מטרה. המיקום התת-תאי של חלבון המטרה הוא גורם נוסף התורם להצלחת IHC לאחר בדיקת FISH. ראינו שספציפיות IHC נשמרת כאשר חלבון המטרה קשור לממברנה, בעוד שהתמקדות IHC בחלבון ציטופלזמי דרשה פתרון בעיות נרחב. לבסוף, מצאנו שהטיפול ברקמה קפואה קבועה המותקנת במגלשה מאתגר יותר מרקמה קפואה טרייה, אולם איכות IHC הייתה בסך הכל טובה יותר עם רקמה קפואה קבועה, בשילוב עם RNAscope.
Introduction
חלבונים ו-mRNA המגדירים באופן נוירוכימי תת-אוכלוסיות של תאי עצב מזוהים בדרך כלל עם שילוב של אימונוהיסטוכימיה (IHC) ו/או הכלאה באתרו (ISH), בהתאמה. שילוב ISH עם טכניקות IHC מאפשר אפיון של דפוסי קולוקליזציה ייחודיים לנוירונים פונקציונליים (קידוד נוירוכימי) על ידי מקסום יכולת התיוג המרובה.
שיטות ISH פלואורסצנטיות (FISH), כולל RNAscope, הן בעלות רגישות וספציפיות גבוהות יותר בהשוואה לשיטות גילוי RNA מוקדמות יותר כגון ISH רדיואקטיבי ו- ISH כרומוגני לא רדיואקטיבי. FISH מאפשר הדמיה של תעתיקי mRNA בודדים ככתמים מוכתמים מנוקבים1. יתר על כן, בדיקת RNAscope מאפשרת לסמן מספר גדל יותר של מטרות RNA בכל פעם, באמצעות תגי פלואורופור שונים. למרות יתרונות אלה, מגבלות טכניות עשויות להשפיע על מספר הפלואורופורים/כרומוגנים שניתן להשתמש בהם בניסוי יחיד. אלה כוללים זמינות של ערכות מסנני מיקרוסקופ; שיקולים אלה מתעצמים כאשר זיהוי נוירוכימי משתמש בשילוב FISH ו-IHC, בהשוואה לשימוש בכל טכניקה בנפרד, שכן צעדים אינהרנטיים אופטימליים לשיטה אחת עלולים להזיק לאחרת.
יישום קודם של FISH בשילוב עם IHC הדגים ביטוי של מטרות תאיות ספציפיות בלימפומות של תאי B אנושיים2, עוברי אפרוחים3, עוברי דגי זברה4, רשתית עכבר5 ותאי אוזן פנימיתשל עכבר 6. במחקרים אלה, הכנת רקמות הייתה או פרפין קבוע פורמלין משובץ (FFPE) 2,3,5 או הר שלם טרי 4,6. מחקרים אחרים יישמו רנ”א כרומוגני על תכשירי מוח קבועיםשל עכברים וחולדות 7,8,9. בפרט, Baleriola et al.8 תיאר שתי תכשירי רקמות שונים עבור ISH-IHC משולב; קטעי מוח קבועים של עכבר ומקטעי מוח אנושיים מסוג FFPE. בפרסום שפורסם לאחרונה, שילבנו FISH ו-IHC פלואורסצנטי על מקטעים קפואים טריים, כדי להמחיש בו זמנית mRNA בשפע נמוך (קולטן גלנין 1, GalR1), mRNA בשפע גבוה (גליצין טרנספורטר 2, GlyT2) וחלבון טרנספורטר אצטילכולין שלפוחית (vAChT)10 במבנה הרשתית של גזע המוח.
גרעין מערכת הבידוד (באנגלית: Nucleus of the Solitary tract או NTS) הוא אזור מרכזי במוח המעורב בתפקוד אוטונומי. אוכלוסייה הטרוגנית זו של תאי עצב, הממוקמת במוח האחורי, מקבלת ומשלבת מספר עצום של אותות אוטונומיים, כולל אלה המווסתים את הנשימה. ה-NTS מכיל מספר אוכלוסיות נוירונים, אשר עשויות להיות מאופיינות פנוטיפית על ידי דפוס הביטוי של מטרות mRNA כולל GalR1 ו-GlyT2 וסמנים חלבוניים עבור האנזים טירוזין הידרוקסילאז (TH) וגורם השעתוק Paired-like homeobox 2b (Phox2b).
הבעלים של RNAscope ממליץ על תכשירים טריים של רקמות קפואות, אך רקמות שהוכנו על ידי קיבוע זילוח טרנסקרדיאלי של בעלי חיים שלמים, יחד עם הגנה קריוגנת לטווח ארוך (אחסון ב -20 מעלות צלזיוס) של חלקי רקמות קפואות קבועות, נפוצים במעבדות רבות. לפיכך, ביקשנו לקבוע פרוטוקולים עבור FISH בשילוב עם IHC באמצעות תכשירי רקמות קפואות טריות וקבועות. כאן, אנו מספקים חלקי מוח קפואים וקבועים טריים: (1) פרוטוקול לשילוב של FISH ו- IHC פלואורסצנטי (2) תיאור של איכות mRNA ותיוג חלבונים המיוצרים, בעת שימוש בכל תכשיר (3) תיאור של ביטוי GalR1 ו- GlyT2 ב- NTS.
המחקר שלנו גילה כי בשילוב עם מתודולוגיית RNAscope, הצלחת IHC השתנתה בתכשירים טריים קפואים וקבועים מוקפאים, והייתה תלויה בלוקליזציה של חלבוני המטרה בתוך התא. בידינו, תיוג חלבונים הקשורים לממברנה היה תמיד מוצלח. לעומת זאת, IHC עבור חלבון ציטופלזמי דרש פתרון בעיות גם במקרים שבהם החלבון הציטופלזמי בא לידי ביטוי יתר בחיה טרנסגנית (Phox2b-GFP)11. לבסוף, בעוד GalR1 מבוטא בנוירונים שאינם קטכולמינרגיים ב-NTS, ביטוי GlyT2 נעדר ב-NTS.
Protocol
Representative Results
Discussion
במדעי המוח, FISH ו-IHC משמשים באופן שגרתי לחקר הארגון המרחבי והמשמעות התפקודית של mRNA או חלבונים בתוך תת-אוכלוסיות עצביות. הפרוטוקול המתואר במחקר זה משפר את היכולת לזיהוי סימולטני של mRNA וחלבונים במקטעי מוח. בדיקת FISH-IHC המשולבת שלנו אפשרה זיהוי פנוטיפי של תת-אוכלוסיות עצביות מובחנות ב-NTS הן בתכש?…
Acknowledgements
עבודה זו מומנה על ידי מענק פרויקט דיסקברי של מועצת המחקר האוסטרלית DP180101890 ומענק פרויקט קרן המחקר הרפואי רבקה ל. קופר PG2018110
Materials
| ANIMALS | |||
| C57BL/6 mouse | Australian BioResources, Moss Vale | MGI: 2159769 | |
| Phox2b-eGFP mouse | Australian BioResources, Moss Vale | MGI: 5776545 | |
| REAGENTS | |||
| Cyanoacrylate | Loctite | ||
| Ethylene Glycol | Sigma-Aldrich | 324558 | |
| Heparin-Sodium | Clifford Hallam Healthcare | 1070760 | Consult local veterinary supplier or pharmacy. |
| Lethabarb (Sodium Pentabarbitol) Euthanasia Injection | Virbac (Australia) Pty Ltd | N/A | Consult a veterinarian for local pharmaceutical regulations regarding Sodium Pentabarbitol |
| Molecular grade agarose powder | Sigma Aldrich | 5077 | |
| OCT Compound, 118mL | Scigen Ltd | 4586 | |
| Paraformaldehyde, prilled, 95% | Sigma-Aldrich | 441244-1KG | |
| Polyvinylpyrrolidone, average mol wt 40,000 (PVP-40) | Sigma-Aldrich | PVP40 | |
| ProLong Gold Antifade Mountant | Invitrogen | P36930 | With or without DAPI |
| RNAscope Multiplex Fluorescent Reagent Kit (up to 3-plex capability) | Advanced Cell Diagnostics, Inc. (ACD Bio) | ADV320850 | Includes 50x Wash buffer and Protease III |
| RNase Away | Thermo-Fisher Scientific | 7003 | |
| Tris(hydroxymethyl)aminomethane | Sigma-Aldrich | 252859 | |
| Tween-20, for molecular biology | Sigma-Aldrich | P9416 | |
| EQUIPMENT | |||
| Benchtop incubator | Thermoline scientific micro incubator | Model: TEI-13G | |
| Brain Matrix, Mouse, 30g Adult, Coronal, 1mm | Ted Pella | 15050 | |
| Cryostat | Leica | CM1950 | |
| Drawing-up needle (23 inch gauge) | BD | 0288U07 | |
| Hydrophobic Barrier Pen | Vector labs | H-4000 | |
| Kimtech Science Kimwipes Delicate Task Wipes | Kimberley Clark Professional | 34120 | |
| Olympus BX51 | Olympus | BX-51 | |
| Peristaltic pump | Coleparmer Masterflex | L/S Series | |
| Retiga 2000R Digital Camera | QImaging | RET-2000R-F-CLR | colour camera |
| SuperFrost Plus Glass Slides (White) | Thermo-Fisher Scientific | 4951PLUS4 | |
| Vibrating Microtome (Vibratome) | Leica | VT1200S | |
| Whatman qualitative filter paper, Grade 1, 110 mm diameter | Merck | WHA1001110 | |
| SOFTWARES | |||
| CorelDRAW | Corel Corporation | Version 7 | |
| FIJI (ImageJ Distribution) | Open Source/GNU General Public Licence (GPL) | N/A | ImageJ 2.x: Rueden, C. T.; Schindelin, J. & Hiner, M. C. et al. (2017), "ImageJ2: ImageJ for the next generation of scientific image data", BMC Bioinformatics 18:529, PMID 29187165, doi:10.1186/s12859-017-1934-z and Fiji: Schindelin, J.; Arganda-Carreras, I. & Frise, E. et al. (2012), "Fiji: an open-source platform for biological-image analysis", Nature methods 9(7): 676-682, PMID 22743772, doi:10.1038/nmeth.2019 |
| PRIMARY ANTIBODIES | |||
| Anti-Tyrosine Hydroxylase Antibody | Millipore Sigma | AB1542 | Sheep polyclonal (1:1000 dilution), RRID: AB_90755 |
| Anti-Tyrosine Hydroxylase Antibody, clone LNC1 | Millipore Sigma | MAB318 | Mouse monoclonal (1:1000 dilution), RRID: AB_2201528 |
| Anti-Vesicular Acetylcholine Transporter (VAchT) Antibody | Sigma-Aldrich | ABN100 | Goat polyclonal (1:1000 dilution), RRID: AB_2630394 |
| GFP Antibody | Novus Biologicals | NB600-308 | Rabbit polyclonal (1:1000 dilution), RRID: AB_10003058 |
| Phox2b Antibody (B-11) | Santa Cruz Biotechnology | sc-376997 | Mouse monoclonal (1:1000 dilution), RRID: AB_2813765 |
| SECONDARY ANTIBODIES | |||
| Alexa Fluor 488 AffiniPure Donkey Anti-Rabbit IgG (H+L) (min X Bov, Ck, Gt, GP, Sy Hms, Hrs, Hu, Ms, Rat, Shp Sr Prot) | Jackson ImmunoResearch | 711-545-152 | Donkey anti-Rabbit (1:400 dilution), RRID: AB_2313584 |
| AMCA AffiniPure Donkey Anti-Sheep IgG (H+L) (min X Ck, GP, Sy Hms, Hrs, Hu, Ms, Rb, Rat Sr Prot) | Jackson ImmunoResearch | 713-155-147 | Donkey anti-Sheep (1:400 dilution), RRID: AB_AB_2340725 |
| Cy5 AffiniPure Donkey Anti-Goat IgG (H+L) (min X Ck, GP, Sy Hms, Hrs, Hu, Ms, Rb, Rat Sr Prot) | Jackson ImmunoResearch | 705-175-147 | Donkey anti-Goat (1:400 dilution), RRID: AB_2340415 |
| Cy5 AffiniPure Donkey Anti-Mouse IgG (H+L) (min X Bov, Ck, Gt, GP, Sy Hms, Hrs, Hu, Rb, Rat, Shp Sr Prot) | Jackson ImmunoResearch | 715-175-151 | Donkey anti-Mouse (1:400 dilution), RRID: AB_2619678 |
| Cy5 AffiniPure Donkey Anti-Sheep IgG (H+L) (min X Ck, GP, Sy Hms, Hrs, Hu, Ms, Rb, Rat Sr Prot) | Jackson ImmunoResearch | 713-175-147 | Donkey anti-Sheep (1:400 dilution), RRID: AB_2340730 |
| RNASCOPE PROBES | |||
| Galanin Receptor 1 oligonucleotide probe | ACDBio | 448821-C1 | targets bp 482 – 1669 (Genebank ref: NM_008082.2) |
| Glycine transporter 2 oligonucleotide probe | ACDBio | 409741-C3 | targets bp 925 – 2153 (Genebank ref: NM_148931.3) |
| Phox2b oligonucleotide probe | ACDBio | 407861-C2 | targets bp 1617 – 2790 (Genebank ref: NM_008888.3) |
References
- Wang, F., et al. RNAscope: a novel in situ RNA analysis platform for formalin-fixed, paraffin-embedded tissues. Journal of Molecular Diagnostics. 14 (1), 22-29 (2012).
- Annese, T., et al. RNAscope dual ISH-IHC technology to study angiogenesis in diffuse large B-cell lymphomas. Histochemistry and Cell Biology. 153 (3), 185-192 (2020).
- Morrison, J. A., McKinney, M. C., Kulesa, P. M. Resolving in vivo gene expression during collective cell migration using an integrated RNAscope, immunohistochemistry and tissue clearing method. Mechanisms of Development. 148, 100-106 (2017).
- Gross-Thebing, T., Paksa, A., Raz, E. Simultaneous high-resolution detection of multiple transcripts combined with localization of proteins in whole-mount embryos. BMC Biology. 12, 55 (2014).
- Stempel, A. J., Morgans, C. W., Stout, J. T., Appukuttan, B. Simultaneous visualization and cell-specific confirmation of RNA and protein in the mouse retina. Molecular Vision. 20, 1366-1373 (2014).
- Kersigo, J., et al. A RNAscope whole mount approach that can be combined with immunofluorescence to quantify differential distribution of mRNA. Cell and Tissue Research. 374 (2), 251-262 (2018).
- Grabinski, T. M., Kneynsberg, A., Manfredsson, F. P., Kanaan, N. M. A method for combining RNAscope in situ hybridization with immunohistochemistry in thick free-floating brain sections and primary neuronal cultures. PLoS One. 10 (3), 0120120 (2015).
- Baleriola, J., Jean, Y., Troy, C., Hengst, U. Detection of axonally localized mRNAs in brain sections using high-resolution in situ hybridization. Journal of Visualized Experiments. (100), e52799 (2015).
- Fe Lanfranco, M., Loane, D. J., Mocchetti, I., Burns, M. P., Villapol, S. Combination of fluorescent in situ hybridization (FISH) and immunofluorescence imaging for detection of cytokine expression in microglia/macrophage cells. Bio-Protocol. 7 (22), (2017).
- Dereli, A. S., Yaseen, Z., Carrive, P., Kumar, N. N. Adaptation of respiratory-related brain regions to long-term hypercapnia: focus on neuropeptides in the RTN. Frontiers in Neuroscience. 13, 1343 (2019).
- Lazarenko, R. M., et al. Acid sensitivity and ultrastructure of the retrotrapezoid nucleus in Phox2b-EGFP transgenic mice. Journal of Comparative Neurology. 517 (1), 69-86 (2009).
- Gage, G. J., Kipke, D. R., Shain, W. Whole animal perfusion fixation for rodents. Journal of Visualized Experiments. (65), e3564 (2012).
- Paxinos, G., Franklin, K. B. . The mouse brain in stereotaxic coordinates. , (2004).
- Abercrombie, M. Estimation of nuclear population from microtome sections. Anatomical Records. 94, 239-247 (1946).
- Kerr, N., et al. The generation of knock-in mice expressing fluorescently tagged galanin receptors 1 and 2. Molecular and Cellular Neurosciences. 68, 258-271 (2015).
- Kachidian, P., Pickel, V. M. Localization of tyrosine hydroxylase in neuronal targets and efferents of the area postrema in the nucleus tractus solitarii of the rat. Journal of Comparative Neurology. 329 (3), 337-353 (1993).
- Stornetta, R. L., et al. Expression of Phox2b by brainstem neurons involved in chemosensory integration in the adult rat. Journal of Neuroscience. 26 (40), 10305-10314 (2006).
- Gilmor, M. L., et al. Expression of the putative vesicular acetylcholine transporter in rat brain and localization in cholinergic synaptic vesicles. Journal of Neuroscience. 16 (7), 2179-2190 (1996).
- Fisher, J. M., Sossin, W., Newcomb, R., Scheller, R. H. Multiple neuropeptides derived from a common precursor are differentially packaged and transported. Cell. 54 (6), 813-822 (1988).
- Towle, A. C., Lauder, J. M., Joh, T. H. Optimization of tyrosine-hydroxylase immunocytochemistry in paraffin sections using pretreatment with proteolytic-enzymes. Journal of Histochemistry and Cytochemistry. 32 (7), 766-770 (1984).
- Biancardi, V., et al. Mapping of the excitatory, inhibitory, and modulatory afferent projections to the anatomically defined active expiratory oscillator in adult male rats. Journal of Comparative Neurology. 529 (4), 853-884 (2021).
- Matthews, D. W., et al. Feedback in the brainstem: an excitatory disynaptic pathway for control of whisking. Journal of Comparative Neurology. 523 (6), 921-942 (2015).
- Ramos-Vara, J. A. Principles and methods of immunohistochemistry. Methods in Molecular Biology. 1641, 115-128 (2017).
- Shi, S. R., Key, M. E., Kalra, K. L. Antigen retrieval in formalin-fixed, paraffin-embedded tissues: an enhancement method for immunohistochemical staining based on microwave oven heating of tissue sections. Journal of Histochemistry and Cytochemistry. 39 (6), 741-748 (1991).
- Yamashita, S., Katsumata, O. Heat-induced antigen retrieval in immunohistochemistry: mechanisms and applications. Methods in Molecular Biology. 1560, 147-161 (2017).
- Yamashita, S., Okada, Y. Mechanisms of heat-induced antigen retrieval: analyses in vitro employing SDS-PAGE and immunohistochemistry. Journal of Histochemistry and Cytochemistry. 53 (1), 13-21 (2005).
- Yamashita, S. Heat-induced antigen retrieval: mechanisms and application to histochemistry. Progress in Histochemistry and Cytochemistry. 41 (3), 141-200 (2007).
