Combinación de hibridación in situ de fluorescencia múltiple con inmunohistoquímica fluorescente en secciones de cerebro de ratón frescas, congeladas o fijas
Summary
Este protocolo describe un método para combinar la hibridación fluorescente in situ (FISH) y la inmunohistoquímica de fluorescencia (IHC) en secciones de cerebro de ratón frescas congeladas y fijas, con el objetivo de lograr una señal de FISH y IHC de fluorescencia multimarca. IHQ se dirigió a proteínas citoplasmáticas y unidas a la membrana.
Abstract
La hibridación fluorescente in situ (FISH) es una técnica molecular que identifica la presencia y distribución espacial de transcritos específicos de ARN dentro de las células. El fenotipado neuroquímico de neuronas identificadas funcionalmente suele requerir un marcaje concurrente con múltiples anticuerpos (proteína diana) mediante inmunohistoquímica (IHQ) y la optimización de la hibridación in situ (ARN dirigido), en conjunto. Se puede lograr una “firma neuroquímica” para caracterizar neuronas particulares, sin embargo, los factores que complican la situación incluyen la necesidad de verificar los objetivos de FISH e IHQ antes de combinar los métodos, y el número limitado de ARN y proteínas que pueden ser atacados simultáneamente dentro de la misma sección de tejido.
Aquí describimos un protocolo, utilizando preparaciones cerebrales de ratón frescas congeladas y fijadas, que detecta múltiples ARNm y proteínas en la misma sección cerebral utilizando RNAscope FISH seguido de inmunotinción de fluorescencia, respectivamente. Utilizamos el método combinado para describir el patrón de expresión de ARNm de baja abundancia (p. ej., receptor de galanina 1) y ARNm de alta abundancia (p. ej., transportador de glicina 2), en núcleos de tronco encefálico identificados inmunohistoquímicamente.
Las consideraciones clave para el etiquetado de proteínas aguas abajo del ensayo FISH van más allá de la preparación de tejidos y la optimización del etiquetado de la sonda FISH. Por ejemplo, descubrimos que la especificidad de unión y etiquetado de anticuerpos puede verse afectada negativamente por el paso de proteasa dentro del ensayo de sonda FISH. Las proteasas catalizan la escisión hidrolítica de los enlaces peptídicos, lo que facilita la entrada de la sonda FISH en las células, sin embargo, también pueden digerir la proteína objetivo del ensayo IHQ posterior, produciendo una unión fuera del objetivo. La localización subcelular de la proteína diana es otro factor que contribuye al éxito de la IHQ tras el ensayo de la sonda FISH. Observamos que la especificidad de la IHQ se conserva cuando la proteína diana está unida a la membrana, mientras que la IHQ dirigida a la proteína citoplasmática requirió una amplia resolución de problemas. Finalmente, encontramos que el manejo del tejido congelado fijo montado en portaobjetos es más desafiante que el tejido congelado fresco, sin embargo, la calidad de la IHQ fue en general mejor con el tejido congelado fijo, cuando se combinó con ARNscope.
Introduction
Las proteínas y los ARNm que definen neuroquímicamente las subpoblaciones de neuronas se identifican comúnmente con una combinación de inmunohistoquímica (IHQ) y/o hibridación in situ (ISH), respectivamente. La combinación de ISH con técnicas IHQ facilita la caracterización de patrones de colocalización exclusivos de las neuronas funcionales (codificación neuroquímica) al maximizar la capacidad de marcaje múltiple.
Los métodos de ISH fluorescentes (FISH), incluido el ARNoscopio, tienen una mayor sensibilidad y especificidad en comparación con los métodos de detección de ARN anteriores, como el ISH radiactivo y el ISH cromogénico no radiactivo. FISH permite la visualización de transcripciones individuales de ARNm como manchas teñidas punteadas1. Además, el ensayo RNAscope permite marcar un mayor número de dianas de ARN a la vez, utilizando diferentes etiquetas de fluoróforos. A pesar de estas ventajas, las limitaciones técnicas pueden afectar al número de fluoróforos/cromógenos que se pueden utilizar en un solo experimento. Estos incluyen la disponibilidad de juegos de filtros de microscopio; estas consideraciones se agravan cuando la identificación neuroquímica utiliza la combinación de FISH e IHQ, en comparación con el uso de cada técnica de forma aislada, ya que los pasos inherentes óptimos para un método pueden ser perjudiciales para el otro.
La aplicación previa de FISH combinada con IHQ ha demostrado la expresión de dianas celulares específicas en linfomas de células B humanas2, embriones de pollo3, embriones de pez cebra4, retina de ratón5 y células del oído interno de ratón6. En estos estudios, la preparación del tejido se realizó en parafina fijada en formol (FFPE)2,3,5 o en montura entera fresca 4,6. Otros estudios aplicaron el ARNoscopio cromogénico en preparaciones fijas de cerebro de ratón y rata 7,8,9. En particular, Baleriola et al.8 describieron dos preparaciones tisulares diferentes para la combinación de ISH-IHC; secciones fijas del cerebro del ratón y secciones del cerebro humano FFPE. En una publicación reciente, combinamos FISH e IHQ fluorescente en secciones frescas congeladas, para visualizar simultáneamente ARNm de baja abundancia (receptor de galanina 1, GalR1), ARNm de alta abundancia (transportador de glicina 2, GlyT2) y proteína10 transportadora vesicular de acetilcolina (vAChT) en la formación reticular del tronco encefálico.
El núcleo del tracto solitario (NTS, por sus siglas en inglés) es una de las principales regiones del cerebro implicada en la función autonómica. Situada en el cerebro posterior, esta población heterogénea de neuronas recibe e integra un gran número de señales autónomas, incluidas las que regulan la respiración. El NTS alberga varias poblaciones neuronales, que pueden caracterizarse fenotípicamente por el patrón de expresión de dianas de ARNm que incluyen GalR1 y GlyT2 y marcadores proteicos para la enzima tirosina hidroxilasa (TH) y el factor de transcripción Paired-like homeobox 2b (Phox2b).
El propietario de RNAscope recomienda preparaciones de tejido fresco congelado, pero el tejido preparado por fijación de perfusión transcárdica de animal entero, junto con la crioprotección a largo plazo (almacenamiento a -20 °C) de secciones fijas de tejido congelado, es común en muchos laboratorios. Por lo tanto, se buscó establecer protocolos para la FISH en combinación con IHQ utilizando preparaciones de tejido fresco congelado y congelado fijo. Aquí, proporcionamos secciones cerebrales frescas congeladas y congeladas fijas: (1) un protocolo para FISH combinado e IHQ fluorescente (2) una descripción de la calidad del ARNm y el marcaje de proteínas producido, cuando se utiliza cada preparación (3) una descripción de la expresión de GalR1 y GlyT2 en el NTS.
Nuestro estudio reveló que, cuando se combinó con la metodología de ARNoscopio, el éxito de la IHC varió en las preparaciones frescas congeladas y congeladas fijas y dependió de la localización de las proteínas diana dentro de la célula. En nuestras manos, el marcaje de proteínas unidas a la membrana siempre tuvo éxito. Por el contrario, la IHQ para la proteína citoplasmática requirió la resolución de problemas incluso en los casos en que la proteína citoplasmática estaba sobreexpresada en un animal transgénico (Phox2b-GFP)11. Finalmente, mientras que GalR1 se expresa en neuronas no catecolaminérgicas en el NTS, la expresión de GlyT2 está ausente en el NTS.
Protocol
Representative Results
Discussion
En las neurociencias, la FISH y la IHQ se utilizan de forma rutinaria para investigar la organización espacial y la importancia funcional del ARNm o las proteínas dentro de las subpoblaciones neuronales. El protocolo descrito en este estudio mejora la capacidad de detección simultánea de ARNm y proteínas en secciones cerebrales. Nuestro ensayo combinado multiplex FISH-IHC permitió la identificación fenotípica de distintas subpoblaciones neuronales en el NTS tanto en preparaciones cerebrales frescas congeladas com…
Acknowledgements
Este trabajo fue financiado por la subvención del Proyecto de Descubrimiento del Consejo de Investigación Australiano DP180101890 y la subvención del proyecto de la Fundación de Investigación Médica Rebecca L Cooper PG2018110
Materials
| ANIMALS | |||
| C57BL/6 mouse | Australian BioResources, Moss Vale | MGI: 2159769 | |
| Phox2b-eGFP mouse | Australian BioResources, Moss Vale | MGI: 5776545 | |
| REAGENTS | |||
| Cyanoacrylate | Loctite | ||
| Ethylene Glycol | Sigma-Aldrich | 324558 | |
| Heparin-Sodium | Clifford Hallam Healthcare | 1070760 | Consult local veterinary supplier or pharmacy. |
| Lethabarb (Sodium Pentabarbitol) Euthanasia Injection | Virbac (Australia) Pty Ltd | N/A | Consult a veterinarian for local pharmaceutical regulations regarding Sodium Pentabarbitol |
| Molecular grade agarose powder | Sigma Aldrich | 5077 | |
| OCT Compound, 118mL | Scigen Ltd | 4586 | |
| Paraformaldehyde, prilled, 95% | Sigma-Aldrich | 441244-1KG | |
| Polyvinylpyrrolidone, average mol wt 40,000 (PVP-40) | Sigma-Aldrich | PVP40 | |
| ProLong Gold Antifade Mountant | Invitrogen | P36930 | With or without DAPI |
| RNAscope Multiplex Fluorescent Reagent Kit (up to 3-plex capability) | Advanced Cell Diagnostics, Inc. (ACD Bio) | ADV320850 | Includes 50x Wash buffer and Protease III |
| RNase Away | Thermo-Fisher Scientific | 7003 | |
| Tris(hydroxymethyl)aminomethane | Sigma-Aldrich | 252859 | |
| Tween-20, for molecular biology | Sigma-Aldrich | P9416 | |
| EQUIPMENT | |||
| Benchtop incubator | Thermoline scientific micro incubator | Model: TEI-13G | |
| Brain Matrix, Mouse, 30g Adult, Coronal, 1mm | Ted Pella | 15050 | |
| Cryostat | Leica | CM1950 | |
| Drawing-up needle (23 inch gauge) | BD | 0288U07 | |
| Hydrophobic Barrier Pen | Vector labs | H-4000 | |
| Kimtech Science Kimwipes Delicate Task Wipes | Kimberley Clark Professional | 34120 | |
| Olympus BX51 | Olympus | BX-51 | |
| Peristaltic pump | Coleparmer Masterflex | L/S Series | |
| Retiga 2000R Digital Camera | QImaging | RET-2000R-F-CLR | colour camera |
| SuperFrost Plus Glass Slides (White) | Thermo-Fisher Scientific | 4951PLUS4 | |
| Vibrating Microtome (Vibratome) | Leica | VT1200S | |
| Whatman qualitative filter paper, Grade 1, 110 mm diameter | Merck | WHA1001110 | |
| SOFTWARES | |||
| CorelDRAW | Corel Corporation | Version 7 | |
| FIJI (ImageJ Distribution) | Open Source/GNU General Public Licence (GPL) | N/A | ImageJ 2.x: Rueden, C. T.; Schindelin, J. & Hiner, M. C. et al. (2017), "ImageJ2: ImageJ for the next generation of scientific image data", BMC Bioinformatics 18:529, PMID 29187165, doi:10.1186/s12859-017-1934-z and Fiji: Schindelin, J.; Arganda-Carreras, I. & Frise, E. et al. (2012), "Fiji: an open-source platform for biological-image analysis", Nature methods 9(7): 676-682, PMID 22743772, doi:10.1038/nmeth.2019 |
| PRIMARY ANTIBODIES | |||
| Anti-Tyrosine Hydroxylase Antibody | Millipore Sigma | AB1542 | Sheep polyclonal (1:1000 dilution), RRID: AB_90755 |
| Anti-Tyrosine Hydroxylase Antibody, clone LNC1 | Millipore Sigma | MAB318 | Mouse monoclonal (1:1000 dilution), RRID: AB_2201528 |
| Anti-Vesicular Acetylcholine Transporter (VAchT) Antibody | Sigma-Aldrich | ABN100 | Goat polyclonal (1:1000 dilution), RRID: AB_2630394 |
| GFP Antibody | Novus Biologicals | NB600-308 | Rabbit polyclonal (1:1000 dilution), RRID: AB_10003058 |
| Phox2b Antibody (B-11) | Santa Cruz Biotechnology | sc-376997 | Mouse monoclonal (1:1000 dilution), RRID: AB_2813765 |
| SECONDARY ANTIBODIES | |||
| Alexa Fluor 488 AffiniPure Donkey Anti-Rabbit IgG (H+L) (min X Bov, Ck, Gt, GP, Sy Hms, Hrs, Hu, Ms, Rat, Shp Sr Prot) | Jackson ImmunoResearch | 711-545-152 | Donkey anti-Rabbit (1:400 dilution), RRID: AB_2313584 |
| AMCA AffiniPure Donkey Anti-Sheep IgG (H+L) (min X Ck, GP, Sy Hms, Hrs, Hu, Ms, Rb, Rat Sr Prot) | Jackson ImmunoResearch | 713-155-147 | Donkey anti-Sheep (1:400 dilution), RRID: AB_AB_2340725 |
| Cy5 AffiniPure Donkey Anti-Goat IgG (H+L) (min X Ck, GP, Sy Hms, Hrs, Hu, Ms, Rb, Rat Sr Prot) | Jackson ImmunoResearch | 705-175-147 | Donkey anti-Goat (1:400 dilution), RRID: AB_2340415 |
| Cy5 AffiniPure Donkey Anti-Mouse IgG (H+L) (min X Bov, Ck, Gt, GP, Sy Hms, Hrs, Hu, Rb, Rat, Shp Sr Prot) | Jackson ImmunoResearch | 715-175-151 | Donkey anti-Mouse (1:400 dilution), RRID: AB_2619678 |
| Cy5 AffiniPure Donkey Anti-Sheep IgG (H+L) (min X Ck, GP, Sy Hms, Hrs, Hu, Ms, Rb, Rat Sr Prot) | Jackson ImmunoResearch | 713-175-147 | Donkey anti-Sheep (1:400 dilution), RRID: AB_2340730 |
| RNASCOPE PROBES | |||
| Galanin Receptor 1 oligonucleotide probe | ACDBio | 448821-C1 | targets bp 482 – 1669 (Genebank ref: NM_008082.2) |
| Glycine transporter 2 oligonucleotide probe | ACDBio | 409741-C3 | targets bp 925 – 2153 (Genebank ref: NM_148931.3) |
| Phox2b oligonucleotide probe | ACDBio | 407861-C2 | targets bp 1617 – 2790 (Genebank ref: NM_008888.3) |
References
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