Combinaison de l’hybridation in situ par fluorescence multiplex avec l’immunohistochimie fluorescente sur des coupes de cerveau de souris fraîches, congelées ou fixes

Les protéines et les ARNm qui définissent neurochimiquement des sous-populations de neurones sont généralement identifiés par une combinaison d’immunohistochimie (IHC) et/ou d’hybridation in situ (ISH), respectivement. La combinaison de l’ISH avec les techniques IHC facilite la caractérisation des patrons de colocalisation propres aux neurones fonctionnels (codage neurochimique) en maximisant la capacité de marquage multiplex.

Les méthodes d’ISH fluorescentes (FISH), y compris l’ARNscope, ont une sensibilité et une spécificité plus élevées que les méthodes antérieures de détection de l’ARN telles que l’ISH radioactive et l’ISH chromogène non radioactive. FISH permet de visualiser des transcrits d’ARNm uniques sous forme de taches colorées ponctuées¹. De plus, le test RNAscope permet de marquer un plus grand nombre de cibles d’ARN à la fois, à l’aide de différents marqueurs fluorophores. Malgré ces avantages, les limitations techniques peuvent affecter le nombre de fluorophores/chromogènes pouvant être utilisés dans une seule expérience. Il s’agit notamment de la disponibilité d’ensembles de filtres pour microscopes ; ces considérations sont aggravées lorsque l’identification neurochimique utilise la combinaison de la FISH et de l’IHC, par rapport à l’utilisation de chaque technique isolément, car les étapes inhérentes optimales à une méthode peuvent être préjudiciables à l’autre.

L’application antérieure de FISH combinée à l’IHC a démontré l’expression de cibles cellulaires spécifiques dans les lymphomes humains à cellules B², les embryons de poussin³, les embryons de poisson-zèbre⁴, la rétine de souris⁵ et les cellules de l’oreille interne de souris⁶. Dans ces études, la préparation des tissus a consisté soit en une paraffine fixée au formol (FFPE)^2,3,5, soit en une monture entière fraîche ^4,6. D’autres études ont appliqué l’ARNscope chromogène à des préparations de cerveaux fixes de souris et de rats ^7,8,9. En particulier, Baleriola et al.⁸ ont décrit deux préparations tissulaires différentes pour l’ISH-IHC combiné ; des sections de cerveau de souris fixes et des sections de cerveau humain FFPE. Dans une publication récente, nous avons combiné le FISH et l’IHC fluorescent sur des coupes fraîches congelées, afin de visualiser simultanément l’ARNm de faible abondance (récepteur de la galanine 1, GalR1), l’ARNm de haute abondance (transporteur de glycine 2, GlyT2) et la protéine vésiculaire transporteur d’acétylcholine (vAChT)¹⁰ dans la formation réticulaire du tronc cérébral.

Le noyau du tractus solitaire (NTS) est une région majeure du cerveau impliquée dans la fonction autonome. Située dans le cerveau postérieur, cette population hétérogène de neurones reçoit et intègre un grand nombre de signaux autonomes, dont ceux qui régulent la respiration. Le NTS abrite plusieurs populations neuronales, qui peuvent être phénotypiquement caractérisées par le modèle d’expression des cibles d’ARNm, y compris GalR1 et GlyT2 et des marqueurs protéiques de l’enzyme tyrosine hydroxylase (TH) et du facteur de transcription Paired-like homeobox 2b (Phox2b).

Le propriétaire du RNAscope recommande des préparations de tissus frais congelés, mais les tissus préparés par fixation par perfusion transcardique d’animaux entiers, ainsi que la cryoprotection à long terme (stockage à -20 °C) de coupes de tissus congelés fixes, sont courants dans de nombreux laboratoires. Par conséquent, nous avons cherché à établir des protocoles pour le FISH en combinaison avec l’IHC en utilisant des préparations de tissus frais congelés et congelés fixes. Ici, nous fournissons pour les coupes de cerveau fraîches congelées et congelées fixes : (1) un protocole pour la combinaison de FISH et d’IHC fluorescent (2) une description de la qualité de l’ARNm et du marquage protéique produit, lors de l’utilisation de chaque préparation, (3) une description de l’expression de GalR1 et GlyT2 dans le NTS.

Notre étude a révélé que, lorsqu’il est combiné avec la méthodologie RNAscope, le succès de l’IHC variait dans les préparations fraîches congelées et fixées et dépendait de la localisation des protéines cibles dans la cellule. Entre nos mains, le marquage des protéines liées à la membrane a toujours été couronné de succès. En revanche, l’IHC pour la protéine cytoplasmique a nécessité un dépannage même dans les cas où la protéine cytoplasmique était surexprimée chez un animal transgénique (Phox2b-GFP)¹¹. Enfin, alors que GalR1 est exprimé dans les neurones non catécholaminergiques du NTS, l’expression de GlyT2 est absente du NTS.