Combinando Hibridização In Situ por Fluorescência Multiplex com Imunohistoquímica Fluorescente em Seções Cerebrais de Camundongos Frescos Congelados ou Fixos
Summary
Este protocolo descreve um método para combinar hibridização in situ fluorescente (FISH) e imunohistoquímica de fluorescência (IHQ) em cortes frescos congelados e fixos de camundongos em cérebros, com o objetivo de obter sinais de FISH multimarcados e IHC de fluorescência. IHQ teve como alvo proteínas citoplasmáticas e ligadas à membrana.
Abstract
Hibridização in situ fluorescente (FISH) é uma técnica molecular que identifica a presença e distribuição espacial de transcritos de RNA específicos dentro das células. A fenotipagem neuroquímica de neurônios funcionalmente identificados geralmente requer marcação simultânea com múltiplos anticorpos (proteína-alvo) usando imunohistoquímica (IHQ) e otimização da hibridização in situ (RNA-alvo), em conjunto. Uma “assinatura neuroquímica” para caracterizar neurônios particulares pode ser alcançada, no entanto, fatores complicadores incluem a necessidade de verificar alvos de FISH e IHQ antes de combinar os métodos, e o número limitado de RNAs e proteínas que podem ser visados simultaneamente dentro da mesma seção de tecido.
Aqui descrevemos um protocolo, usando preparações cerebrais de camundongos frescos congelados e fixos, que detecta múltiplos mRNAs e proteínas na mesma seção cerebral usando RNAscope FISH seguido de imunomarcação por fluorescência, respectivamente. Usamos o método combinado para descrever o padrão de expressão de mRNAs de baixa abundância (por exemplo, receptor de galanina 1) e mRNAs de alta abundância (por exemplo, transportador de glicina 2), em núcleos do tronco cerebral imunohistoquimicamente identificados.
As principais considerações para a rotulagem de proteínas a jusante do ensaio FISH vão além da preparação de tecidos e da otimização da rotulagem de sondas de FISH. Por exemplo, descobrimos que a especificidade de ligação e rotulagem de anticorpos pode ser afetada negativamente pela etapa de protease dentro do ensaio de sonda FISH. As proteases catalisam a clivagem hidrolítica de ligações peptídicas, facilitando a entrada da sonda FISH nas células, mas também podem digerir a proteína alvo do ensaio IHQ subsequente, produzindo ligação fora do alvo. A localização subcelular da proteína-alvo é outro fator que contribui para o sucesso da IHQ após o ensaio com sonda FISH. Observamos que a especificidade da IHQ deve ser retida quando a proteína-alvo está ligada à membrana, enquanto a IHQ direcionada à proteína citoplasmática requer solução de problemas extensa. Finalmente, achamos que o manuseio do tecido congelado fixo montado em lâmina é mais desafiador do que o tecido fresco congelado, no entanto, a qualidade da IHQ foi globalmente melhor com o tecido congelado fixo, quando combinado com o RNAscope.
Introduction
Proteínas e RNAm que definem neuroquimicamente subpopulações de neurônios são comumente identificados com uma combinação de imunohistoquímica (IHQ) e/ou hibridização in situ (ISH), respectivamente. A combinação de ISH com técnicas de IHQ facilita a caracterização de padrões de colocalização exclusivos de neurônios funcionais (codificação neuroquímica), maximizando a capacidade de marcação multiplex.
Métodos de ISH fluorescente (FISH), incluindo RNAscope, têm maior sensibilidade e especificidade em comparação com métodos anteriores de detecção de RNA, como ISH radioativa e ISH cromogênica não radioativa. O FISH permite a visualização de transcritos de RNAm único como pontos corados puntiformes1. Além disso, o ensaio RNAscope permite que um número maior de alvos de RNA seja marcado de cada vez, usando diferentes tags de fluoróforo. Apesar dessas vantagens, limitações técnicas podem afetar o número de fluoróforos/cromógenos que podem ser utilizados em um único experimento. Estes incluem a disponibilidade de conjuntos de filtros para microscópios; tais considerações são agravadas quando a identificação neuroquímica utiliza FISH e IHQ combinadas, em comparação com o uso de cada técnica isoladamente, uma vez que etapas inerentes ótimas para um método podem ser prejudiciais para o outro.
A aplicação prévia de FISH combinada com IHQ demonstrou a expressão de alvos celulares específicos em linfomas de células B humanas2, embriões de pintinhos3, embriões de peixe-zebra4, retina de camundongo 5 e células da orelha internade camundongos6. Nesses estudos, o preparo tecidual foi fixado em formalina e incluído em parafina (FFPE)2,3,5 ou montaria inteira a fresco 4,6. Outros estudos aplicaram o RNAscópio cromogênico em preparações cerebrais fixas de camundongos e ratos 7,8,9. Em particular, Baleriola et al.8 descreveram duas preparações teciduais diferentes para a combinação de IHQ-HIS; seções fixas do cérebro de camundongos e seções do cérebro humano FFPE. Em uma publicação recente, combinamos FISH e IHQ fluorescente em cortes frescos congelados, para visualizar simultaneamente mRNA de baixa abundância (receptor de galanina 1, GalR1), mRNA de alta abundância (transportador de glicina 2, GlyT2) e proteína10 do transportador vesicular de acetilcolina (vAChT) na formação reticular do tronco encefálico.
O núcleo do trato solitário (NTS) é uma importante região cerebral envolvida na função autonômica. Localizada no rombencéfalo, essa população heterogênea de neurônios recebe e integra um vasto número de sinais autonômicos, incluindo aqueles que regulam a respiração. O NTS abriga várias populações neuronais, que podem ser fenotipicamente caracterizadas pelo padrão de expressão de alvos de RNAm, incluindo GalR1 e GlyT2 e marcadores proteicos para a enzima tirosina hidroxilase (TH) e o fator de transcrição Paired-like homeobox 2b (Phox2b).
O proprietário do RNAscope recomenda preparações de tecidos frescos congelados, mas o tecido preparado por fixação transcárdica de perfusão animal inteiro, juntamente com crioproteção a longo prazo (armazenamento a -20 °C) de cortes fixos de tecido congelado, é comum em muitos laboratórios. Assim, buscou-se estabelecer protocolos para FISH em combinação com IHQ utilizando preparações de tecidos frescos congelados e congelados fixos. Aqui, nós fornecemos para seções de cérebro congelado fresco e congelado fixo: (1) um protocolo para FISH combinado e IHC fluorescente (2) uma descrição da qualidade do mRNA e rotulagem de proteínas produzidas, ao utilizar cada preparação (3) uma descrição da expressão de GalR1 e GlyT2 no NTS.
Nosso estudo revelou que, quando combinado com a metodologia RNAscope, o sucesso da IHQ variou em preparações congeladas frescas e fixas, dependendo da localização das proteínas-alvo dentro da célula. Em nossas mãos, a rotulagem de proteínas ligadas à membrana sempre foi bem-sucedida. Em contraste, a IHQ para proteína citoplasmática exigiu solução de problemas mesmo nos casos em que a proteína citoplasmática foi superexpressa em um animal transgênico (Phox2b-GFP)11. Finalmente, enquanto GalR1 é expressa em neurônios não-catecolaminérgicos no NTS, a expressão de GlyT2 está ausente no NTS.
Protocol
Representative Results
Discussion
Nas neurociências, FISH e IHQ são rotineiramente usadas para investigar a organização espacial e o significado funcional de RNAm ou proteínas dentro de subpopulações neuronais. O protocolo descrito neste estudo aumenta a capacidade de detecção simultânea de mRNAs e proteínas em cortes cerebrais. Nosso ensaio combinado multiplex FISH-IHC permitiu a identificação fenotípica de subpopulações neuronais distintas no NTS em preparações cerebrais frescas congeladas e fixas. A IHQ de FISH em preparações de te…
Acknowledgements
Este trabalho foi financiado pelo Australian Research Council Discovery Project grant DP180101890 e Rebecca L Cooper Medical Research Foundation grant PG2018110
Materials
| ANIMALS | |||
| C57BL/6 mouse | Australian BioResources, Moss Vale | MGI: 2159769 | |
| Phox2b-eGFP mouse | Australian BioResources, Moss Vale | MGI: 5776545 | |
| REAGENTS | |||
| Cyanoacrylate | Loctite | ||
| Ethylene Glycol | Sigma-Aldrich | 324558 | |
| Heparin-Sodium | Clifford Hallam Healthcare | 1070760 | Consult local veterinary supplier or pharmacy. |
| Lethabarb (Sodium Pentabarbitol) Euthanasia Injection | Virbac (Australia) Pty Ltd | N/A | Consult a veterinarian for local pharmaceutical regulations regarding Sodium Pentabarbitol |
| Molecular grade agarose powder | Sigma Aldrich | 5077 | |
| OCT Compound, 118mL | Scigen Ltd | 4586 | |
| Paraformaldehyde, prilled, 95% | Sigma-Aldrich | 441244-1KG | |
| Polyvinylpyrrolidone, average mol wt 40,000 (PVP-40) | Sigma-Aldrich | PVP40 | |
| ProLong Gold Antifade Mountant | Invitrogen | P36930 | With or without DAPI |
| RNAscope Multiplex Fluorescent Reagent Kit (up to 3-plex capability) | Advanced Cell Diagnostics, Inc. (ACD Bio) | ADV320850 | Includes 50x Wash buffer and Protease III |
| RNase Away | Thermo-Fisher Scientific | 7003 | |
| Tris(hydroxymethyl)aminomethane | Sigma-Aldrich | 252859 | |
| Tween-20, for molecular biology | Sigma-Aldrich | P9416 | |
| EQUIPMENT | |||
| Benchtop incubator | Thermoline scientific micro incubator | Model: TEI-13G | |
| Brain Matrix, Mouse, 30g Adult, Coronal, 1mm | Ted Pella | 15050 | |
| Cryostat | Leica | CM1950 | |
| Drawing-up needle (23 inch gauge) | BD | 0288U07 | |
| Hydrophobic Barrier Pen | Vector labs | H-4000 | |
| Kimtech Science Kimwipes Delicate Task Wipes | Kimberley Clark Professional | 34120 | |
| Olympus BX51 | Olympus | BX-51 | |
| Peristaltic pump | Coleparmer Masterflex | L/S Series | |
| Retiga 2000R Digital Camera | QImaging | RET-2000R-F-CLR | colour camera |
| SuperFrost Plus Glass Slides (White) | Thermo-Fisher Scientific | 4951PLUS4 | |
| Vibrating Microtome (Vibratome) | Leica | VT1200S | |
| Whatman qualitative filter paper, Grade 1, 110 mm diameter | Merck | WHA1001110 | |
| SOFTWARES | |||
| CorelDRAW | Corel Corporation | Version 7 | |
| FIJI (ImageJ Distribution) | Open Source/GNU General Public Licence (GPL) | N/A | ImageJ 2.x: Rueden, C. T.; Schindelin, J. & Hiner, M. C. et al. (2017), "ImageJ2: ImageJ for the next generation of scientific image data", BMC Bioinformatics 18:529, PMID 29187165, doi:10.1186/s12859-017-1934-z and Fiji: Schindelin, J.; Arganda-Carreras, I. & Frise, E. et al. (2012), "Fiji: an open-source platform for biological-image analysis", Nature methods 9(7): 676-682, PMID 22743772, doi:10.1038/nmeth.2019 |
| PRIMARY ANTIBODIES | |||
| Anti-Tyrosine Hydroxylase Antibody | Millipore Sigma | AB1542 | Sheep polyclonal (1:1000 dilution), RRID: AB_90755 |
| Anti-Tyrosine Hydroxylase Antibody, clone LNC1 | Millipore Sigma | MAB318 | Mouse monoclonal (1:1000 dilution), RRID: AB_2201528 |
| Anti-Vesicular Acetylcholine Transporter (VAchT) Antibody | Sigma-Aldrich | ABN100 | Goat polyclonal (1:1000 dilution), RRID: AB_2630394 |
| GFP Antibody | Novus Biologicals | NB600-308 | Rabbit polyclonal (1:1000 dilution), RRID: AB_10003058 |
| Phox2b Antibody (B-11) | Santa Cruz Biotechnology | sc-376997 | Mouse monoclonal (1:1000 dilution), RRID: AB_2813765 |
| SECONDARY ANTIBODIES | |||
| Alexa Fluor 488 AffiniPure Donkey Anti-Rabbit IgG (H+L) (min X Bov, Ck, Gt, GP, Sy Hms, Hrs, Hu, Ms, Rat, Shp Sr Prot) | Jackson ImmunoResearch | 711-545-152 | Donkey anti-Rabbit (1:400 dilution), RRID: AB_2313584 |
| AMCA AffiniPure Donkey Anti-Sheep IgG (H+L) (min X Ck, GP, Sy Hms, Hrs, Hu, Ms, Rb, Rat Sr Prot) | Jackson ImmunoResearch | 713-155-147 | Donkey anti-Sheep (1:400 dilution), RRID: AB_AB_2340725 |
| Cy5 AffiniPure Donkey Anti-Goat IgG (H+L) (min X Ck, GP, Sy Hms, Hrs, Hu, Ms, Rb, Rat Sr Prot) | Jackson ImmunoResearch | 705-175-147 | Donkey anti-Goat (1:400 dilution), RRID: AB_2340415 |
| Cy5 AffiniPure Donkey Anti-Mouse IgG (H+L) (min X Bov, Ck, Gt, GP, Sy Hms, Hrs, Hu, Rb, Rat, Shp Sr Prot) | Jackson ImmunoResearch | 715-175-151 | Donkey anti-Mouse (1:400 dilution), RRID: AB_2619678 |
| Cy5 AffiniPure Donkey Anti-Sheep IgG (H+L) (min X Ck, GP, Sy Hms, Hrs, Hu, Ms, Rb, Rat Sr Prot) | Jackson ImmunoResearch | 713-175-147 | Donkey anti-Sheep (1:400 dilution), RRID: AB_2340730 |
| RNASCOPE PROBES | |||
| Galanin Receptor 1 oligonucleotide probe | ACDBio | 448821-C1 | targets bp 482 – 1669 (Genebank ref: NM_008082.2) |
| Glycine transporter 2 oligonucleotide probe | ACDBio | 409741-C3 | targets bp 925 – 2153 (Genebank ref: NM_148931.3) |
| Phox2b oligonucleotide probe | ACDBio | 407861-C2 | targets bp 1617 – 2790 (Genebank ref: NM_008888.3) |
References
- Wang, F., et al. RNAscope: a novel in situ RNA analysis platform for formalin-fixed, paraffin-embedded tissues. Journal of Molecular Diagnostics. 14 (1), 22-29 (2012).
- Annese, T., et al. RNAscope dual ISH-IHC technology to study angiogenesis in diffuse large B-cell lymphomas. Histochemistry and Cell Biology. 153 (3), 185-192 (2020).
- Morrison, J. A., McKinney, M. C., Kulesa, P. M. Resolving in vivo gene expression during collective cell migration using an integrated RNAscope, immunohistochemistry and tissue clearing method. Mechanisms of Development. 148, 100-106 (2017).
- Gross-Thebing, T., Paksa, A., Raz, E. Simultaneous high-resolution detection of multiple transcripts combined with localization of proteins in whole-mount embryos. BMC Biology. 12, 55 (2014).
- Stempel, A. J., Morgans, C. W., Stout, J. T., Appukuttan, B. Simultaneous visualization and cell-specific confirmation of RNA and protein in the mouse retina. Molecular Vision. 20, 1366-1373 (2014).
- Kersigo, J., et al. A RNAscope whole mount approach that can be combined with immunofluorescence to quantify differential distribution of mRNA. Cell and Tissue Research. 374 (2), 251-262 (2018).
- Grabinski, T. M., Kneynsberg, A., Manfredsson, F. P., Kanaan, N. M. A method for combining RNAscope in situ hybridization with immunohistochemistry in thick free-floating brain sections and primary neuronal cultures. PLoS One. 10 (3), 0120120 (2015).
- Baleriola, J., Jean, Y., Troy, C., Hengst, U. Detection of axonally localized mRNAs in brain sections using high-resolution in situ hybridization. Journal of Visualized Experiments. (100), e52799 (2015).
- Fe Lanfranco, M., Loane, D. J., Mocchetti, I., Burns, M. P., Villapol, S. Combination of fluorescent in situ hybridization (FISH) and immunofluorescence imaging for detection of cytokine expression in microglia/macrophage cells. Bio-Protocol. 7 (22), (2017).
- Dereli, A. S., Yaseen, Z., Carrive, P., Kumar, N. N. Adaptation of respiratory-related brain regions to long-term hypercapnia: focus on neuropeptides in the RTN. Frontiers in Neuroscience. 13, 1343 (2019).
- Lazarenko, R. M., et al. Acid sensitivity and ultrastructure of the retrotrapezoid nucleus in Phox2b-EGFP transgenic mice. Journal of Comparative Neurology. 517 (1), 69-86 (2009).
- Gage, G. J., Kipke, D. R., Shain, W. Whole animal perfusion fixation for rodents. Journal of Visualized Experiments. (65), e3564 (2012).
- Paxinos, G., Franklin, K. B. . The mouse brain in stereotaxic coordinates. , (2004).
- Abercrombie, M. Estimation of nuclear population from microtome sections. Anatomical Records. 94, 239-247 (1946).
- Kerr, N., et al. The generation of knock-in mice expressing fluorescently tagged galanin receptors 1 and 2. Molecular and Cellular Neurosciences. 68, 258-271 (2015).
- Kachidian, P., Pickel, V. M. Localization of tyrosine hydroxylase in neuronal targets and efferents of the area postrema in the nucleus tractus solitarii of the rat. Journal of Comparative Neurology. 329 (3), 337-353 (1993).
- Stornetta, R. L., et al. Expression of Phox2b by brainstem neurons involved in chemosensory integration in the adult rat. Journal of Neuroscience. 26 (40), 10305-10314 (2006).
- Gilmor, M. L., et al. Expression of the putative vesicular acetylcholine transporter in rat brain and localization in cholinergic synaptic vesicles. Journal of Neuroscience. 16 (7), 2179-2190 (1996).
- Fisher, J. M., Sossin, W., Newcomb, R., Scheller, R. H. Multiple neuropeptides derived from a common precursor are differentially packaged and transported. Cell. 54 (6), 813-822 (1988).
- Towle, A. C., Lauder, J. M., Joh, T. H. Optimization of tyrosine-hydroxylase immunocytochemistry in paraffin sections using pretreatment with proteolytic-enzymes. Journal of Histochemistry and Cytochemistry. 32 (7), 766-770 (1984).
- Biancardi, V., et al. Mapping of the excitatory, inhibitory, and modulatory afferent projections to the anatomically defined active expiratory oscillator in adult male rats. Journal of Comparative Neurology. 529 (4), 853-884 (2021).
- Matthews, D. W., et al. Feedback in the brainstem: an excitatory disynaptic pathway for control of whisking. Journal of Comparative Neurology. 523 (6), 921-942 (2015).
- Ramos-Vara, J. A. Principles and methods of immunohistochemistry. Methods in Molecular Biology. 1641, 115-128 (2017).
- Shi, S. R., Key, M. E., Kalra, K. L. Antigen retrieval in formalin-fixed, paraffin-embedded tissues: an enhancement method for immunohistochemical staining based on microwave oven heating of tissue sections. Journal of Histochemistry and Cytochemistry. 39 (6), 741-748 (1991).
- Yamashita, S., Katsumata, O. Heat-induced antigen retrieval in immunohistochemistry: mechanisms and applications. Methods in Molecular Biology. 1560, 147-161 (2017).
- Yamashita, S., Okada, Y. Mechanisms of heat-induced antigen retrieval: analyses in vitro employing SDS-PAGE and immunohistochemistry. Journal of Histochemistry and Cytochemistry. 53 (1), 13-21 (2005).
- Yamashita, S. Heat-induced antigen retrieval: mechanisms and application to histochemistry. Progress in Histochemistry and Cytochemistry. 41 (3), 141-200 (2007).
