Transplante Sub-Retiniano de Tecido Retiniano Derivado de Células-Tronco Embrionárias Humanas em Modelo Animal de Grande Porte Felino

Milhões de pessoas em todo o mundo são afetadas pela degeneração retiniana (DR) com consequente deficiência visual ou cegueira associada à perda dos fotorreceptores (RPs) sensíveis à luz. A degeneração macular relacionada à idade (DMRI) é uma das principais causas de cegueira resultante de uma combinação de fatores de risco genéticos e fatores ambientais/estilo de vida. Além disso, mais de 200 genes e loci causaram DR hereditária (IRD)¹. A retinose pigmentar (PR), a mais comum DIR, é geneticamente heterogênea, com mais de 3.000 mutações genéticas em aproximadamente 70 genes relatadas2,3,4. A Amaurose Congênita de Leber (LAC), que causa cegueira na infância, também é geneticamente heterogênea5,6. A terapia de aumento gênico foi desenvolvida e está em ensaios clínicos para o tratamento de um pequeno número de IRDs ^3,7. No entanto, uma terapia separada deve ser desenvolvida para o tratamento de cada forma genética distinta de IRD e, assim, tratar apenas um pequeno subgrupo de pacientes. Além disso, o aumento gênico depende da presença de uma população de fotorreceptores resgatáveis e, portanto, não é aplicável para degeneração avançada.

Há, portanto, uma necessidade clínica urgente e ainda não atendida para o desenvolvimento de terapias que abordem e tratem as DRs avançadas e a cegueira profunda a terminal. Nas últimas 2 décadas implantes neuroprotéticos foram desenvolvidos e testados em modelos animais de grande porte, como o gato, antes do uso humano 8,9,10,11,12,13,14. Da mesma forma, nos últimos 20 anos, terapias de reposição retiniana utilizando lâminas de retina de mamíferos embrionárias ou mesmo maduras enxertadas sub-retinicamente foram desenvolvidas 15,16,17,18,19,20,21,22 e até testadas com sucesso em pacientes com DR ^23,24,25. Ambas as abordagens utilizam a ideia de introduzir novos sensores (fotodiodos fotovoltaicos de silício, no caso de dispositivos neuroprotéticos26,27, e fotorreceptores saudáveis livres de mutação organizados em folhas^, no caso de implantação de folhas de retina) em retinas com RPs degenerados. Estudos recentes têm investigado o uso de abordagens baseadas em células-tronco, como o transplante de progenitores retinianos derivados de células-tronco pluripotentes humanas (hPSC)^28,29, fotorreceptores hPSC 30 e organoides retinianos hPSC^31,32,33. Os organoides da retina permitem a formação de tecido retiniano em uma placa e derivação de folhas fotorreceptoras com milhares de RPs livres de mutação, que se assemelham à camada fotorreceptora da retina fetal humana em desenvolvimento 34,35,36,37,38,39,40 . O transplante de tecido retiniano derivado de hPSC (organoides) para o espaço sub-retiniano de pacientes com DR é uma das novas e promissoras abordagens de terapia celular investigativa, sendo perseguida por várias equipes31,32,41,42. Em comparação com o transplante da suspensão celular (de fotorreceptores jovens ou progenitores da retina), folhas transplantadas de fotorreceptores fetais demonstraram resultar em melhora da visão em ensaios clínicos^23,24.

O protocolo aqui apresentado descreve, em detalhes, um procedimento de transplante para liberação sub-retiniana de organoides da retina inteira (em vez de bordas organoides33,41) como uma maneira potencialmente melhor de introduzir lâminas retinianas intactas com RPs^, para aumentar a sobrevida do enxerto e melhorar a preservação do lençol. Embora procedimentos para introdução de um pedaço plano de retina humana e também de placas de EPR tenham sido desenvolvidos^43,44,45, o transplante de enxertos 3D maiores ainda não foi investigado. Os organoides da retina derivados de células-tronco fornecem uma fonte inesgotável de folhas fotorreceptoras para o desenvolvimento de tecnologias de restauração da visão, são livres de restrições éticas e são considerados uma excelente fonte de tecido retiniano humano para terapias focadas no tratamento da DR avançada e cegueira terminal⁴⁶. O desenvolvimento de métodos cirúrgicos para implante sub-retiniano preciso de organoides da retina com mínima lesão do nicho retiniano do hospedeiro (retina neural, epitélio pigmentado da retina e vasculatura retiniana e coroidal) é um dos passos críticos para o avanço dessa terapia para aplicações^{clínicas31,32}. Modelos animais de grande porte, como gatos, cães, porcos e macacos, têm se mostrado bons modelos para investigar métodos de parto cirúrgico, bem como para demonstrar a segurança de lâminas de tecido implantadas (células do epitélio pigmentado da retina (EPR)) e investigar o uso de organoides 41,44,45,47,48,49,50 . O olho do grande animal tem tamanho de globo semelhante ao humano, bem como anatomia semelhante, incluindo a presença de uma região de alta densidade de fotorreceptores, incluindo cones (a área central), assemelhando-se à mácula humana 6,51,52.

Neste manuscrito, é descrita uma técnica para a implantação de tecido retiniano derivado de hPSC (organoides) no espaço sub-retiniano de modelos de animais grandes felinos (gatos selvagens e Crx^Rdy/+) que, juntamente com resultados promissores de eficácia32,53, constrói uma base para o desenvolvimento posterior dessa terapia experimental em direção a aplicações clínicas no tratamento de condições de DR.