Subretinale transplantatie van menselijk embryonaal stamcel-afgeleid retinaal weefsel in een katachtig groot diermodel

Miljoenen mensen over de hele wereld worden beïnvloed door retinale degeneratie (RD) met als gevolg een visuele beperking of blindheid geassocieerd met verlies van de lichtgevoelige fotoreceptoren (PR’s). Leeftijdsgebonden maculaire degeneratie (AMD) is een belangrijke oorzaak van blindheid als gevolg van een combinatie van genetische risicofactoren en omgevings- / levensstijlfactoren. Daarnaast is gebleken dat meer dan 200 genen en loci erfelijke RD (IRD)¹ veroorzaken. Retinitis pigmentosa (RP), de meest voorkomende IRD, is genetisch heterogeen met meer dan 3.000 genetische mutaties in ongeveer 70 genen die ^2,3,4 worden gerapporteerd. Leber Congenitale Amaurosis (LCA), die blindheid in de kindertijd veroorzaakt, is ook genetisch heterogeen ^5,6. Genaugmentatietherapie is ontwikkeld en bevindt zich in klinische onderzoeken voor de behandeling van een klein aantal IRD’s ^3,7. Er moet echter een afzonderlijke therapie worden ontwikkeld voor de behandeling van elke afzonderlijke genetische vorm van IRD en daarbij slechts een kleine subgroep van patiënten behandelen. Bovendien is genvergroting afhankelijk van de aanwezigheid van een populatie van te redden fotoreceptoren en is daarom niet van toepassing op gevorderde degeneratie.

Er is daarom een dringende en nog onvervulde klinische behoefte aan de ontwikkeling van therapieën die geavanceerde RD’s en diepgaande tot terminale blindheid aanpakken en behandelen. In de afgelopen 2 decennia zijn neuroprothetische implantaten ontwikkeld en getest in grote diermodellen, zoals de kat, voorafgaand aan menselijk gebruik 8,9,10,11,12,13,14. Evenzo zijn in de afgelopen 20 jaar retinale vervangingstherapieën met behulp van vellen embryonaal of zelfs volwassen netvlies van zoogdieren die subretinaal zijn getransplanteerd, ontwikkeld 15,16,17,18,19,20,21,22 en zelfs met succes getest bij RD-patiënten ^23,24,25. Beide benaderingen maken gebruik van het idee om nieuwe sensoren (fotovoltaïsche siliciumfotodiodes in het geval van neuroprothetische apparaten^26,27, en gezonde mutatievrije fotoreceptoren georganiseerd in vellen^, in het geval van retinale plaatimplantatie) in het netvlies te introduceren met gedegenereerde PR’s. Recente studies hebben het gebruik van op stamcellen gebaseerde benaderingen onderzocht, zoals transplantatie van menselijke pluripotente stamcellen (hPSC)-afgeleide retinale voorlopers^28,29, hPSC-fotoreceptoren 30 en hPSC-retinale organoïden^31,32,33. Retinale organoïden maken de vorming van netvliesweefsel in een schaal mogelijk en afleiding van fotoreceptorvellen met duizenden mutatievrije PR’s, die lijken op de fotoreceptorlaag in het zich ontwikkelende menselijke foetale netvlies 34,35,36,37,38,39,40 . Het transplanteren van hPSC-afgeleid retinaal weefsel (organoïden) in de subretinale ruimte van patiënten met RD-aandoeningen is een van de nieuwe en veelbelovende benaderingen voor experimentele celtherapie, die wordt nagestreefd door een aantal teams^31,32,41,42. Vergeleken met transplantatie van de celsuspensie (van jonge fotoreceptoren of retinale voorlopercellen), werd aangetoond dat getransplanteerde vellen foetale fotoreceptoren resulteerden in verbeteringen in het gezichtsvermogen in klinische onderzoeken^23,24.

Het hier gepresenteerde protocol beschrijft in detail een transplantatieprocedure voor subretinale toediening van de gehele retinale organoïden (in plaats van organoïde randen^33,41) als een potentieel betere manier om intacte retinale vellen met PR’s te introduceren^, om de overleving van het transplantaat te vergroten en de bladconservering te verbeteren. Hoewel procedures voor het introduceren van een plat stuk menselijk netvlies en ook RPE-pleisters zijn ontwikkeld^43,44,45, is transplantatie van grotere 3D-grafts niet onderzocht. Van stamcellen afgeleide retinale organoïden bieden een onuitputtelijke bron van fotoreceptorbladen voor het ontwikkelen van technologieën voor het herstel van het gezichtsvermogen, zijn vrij van ethische beperkingen en worden beschouwd als een uitstekende bron van menselijk netvliesweefsel voor therapieën gericht op de behandeling van gevorderde RD en terminale blindheid⁴⁶. De ontwikkeling van chirurgische methoden voor nauwkeurige subretinale implantatie van retinale organoïden met minimaal letsel aan de retinale niche van de gastheer (neuraal netvlies, retinaal pigmentepitheel en retinale en choroïdale vasculatuur) is een van de kritieke stappen voor het bevorderen van dergelijke therapie in de richting van klinische toepassingen^31,32. Grote diermodellen zoals katten, honden, varkens en apen hebben bewezen goede modellen te zijn voor het onderzoeken van chirurgische toedieningsmethoden en om de veiligheid van geïmplanteerde vellen weefsel (retinale pigmentepitheel (RPE) cellen) aan te tonen en het gebruik van organoïden te onderzoeken 41,44,45,47,48,49,50 . Het grote dierlijke oog heeft een vergelijkbare bolgrootte als de mens en een vergelijkbare anatomie, waaronder de aanwezigheid van een gebied met een hoge fotoreceptordichtheid, inclusief kegeltjes (het centrale gebied), dat lijkt op de menselijke macula 6,51,52.

In dit manuscript wordt een techniek beschreven voor de implantatie van hPSC-afgeleid retinaal weefsel (organoïden) in de subretinale ruimte van katachtige grote diermodellen (zowel wild-type als Crx^{Rdy / +} katten), die, samen met veelbelovende werkzaamheidsresultaten^32,53, een basis vormt voor verdere ontwikkeling van dergelijke onderzoekstherapie in de richting van klinische toepassingen om RD-aandoeningen te behandelen.