Субретинальная трансплантация ткани сетчатки, полученной из эмбриональных стволовых клеток человека, на модели крупного крупного животного кошки

Миллионы людей во всем мире страдают от дегенерации сетчатки (РД), что приводит к ухудшению зрения или слепоте, связанной с потерей светочувствительных фоторецепторов (ПР). Возрастная макулярная дегенерация (ВМД) является основной причиной слепоты, возникающей в результате сочетания генетических факторов риска и факторов окружающей среды / образа жизни. Кроме того, было обнаружено, что более 200 генов и локусов вызывают наследственный RD (IRD)¹. Пигментный ретинит (RP), самый распространенный IRD, генетически неоднороден: сообщается о более чем 3000 генетических мутациях примерно в 70 генах ^2,3,4. Врожденный амавроз Лебера (LCA), вызывающий слепоту в детском возрасте, также генетически гетероген ^5,6. Генная аугментационная терапия была разработана и находится в клинических испытаниях для лечения небольшого числа IRD ^3,7. Тем не менее, отдельная терапия должна быть разработана для лечения каждой отдельной генетической формы IRD и, таким образом, лечения только небольшой подгруппы пациентов. Кроме того, аугментация генов основана на наличии популяции восстанавливаемых фоторецепторов и, следовательно, неприменима для прогрессирующей дегенерации.

Таким образом, существует настоятельная и еще неудовлетворенная клиническая потребность в разработке методов лечения, направленных на лечение и лечение прогрессирующих РД и глубокой до неизлечимой слепоты. За последние 2 десятилетия нейропротезные имплантаты были разработаны и испытаны на моделях крупных животных, таких как кошка, до использования человеком 8,9,10,11,12,13,14. Аналогичным образом, за последние 20 лет была разработана заместительная терапия сетчатки с использованием листов эмбриональной или даже зрелой сетчатки млекопитающих, пересаженных субретинально 15,16,17,18,19,20,21,22 и даже успешно протестирована у пациентов с РД ^23,24,25. Оба подхода используют идею введения новых датчиков (фотоэлектрических кремниевых фотодиодов в случае нейропротезов^26,27 и здоровых безмутационных фоторецепторов, организованных в листы^, в случае имплантации листа сетчатки) в сетчатку с дегенерированными PR. В недавних исследованиях изучалось использование подходов, основанных на стволовых клетках, таких как трансплантация предшественников сетчатки, полученных из плюрипотентных стволовых клеток человека (hPSC)^28,29, фоторецепторов hPSC 30 и органоидов сетчатки^{hPSC 31,32,33}. Органоиды сетчатки позволяют формировать ткань сетчатки в чашке и получать фоторецепторные листы с тысячами безмутационных PR, которые напоминают слой фоторецепторов в развивающейся сетчатке плода человека 34,35,36,37,38,39,40. Трансплантация ткани сетчатки (органоидов), полученной из hPSC, в субретинальное пространство пациентов с заболеваниями РД является одним из новых и перспективных исследовательских подходов к клеточной терапии, применяемых рядом команд 31,32,41,42. По сравнению с трансплантацией клеточной суспензии (молодых фоторецепторов или предшественников сетчатки) было продемонстрировано, что трансплантированные листы фоторецепторов плода приводят к улучшению зрения в клинических испытаниях^23,24.

Представленный здесь протокол подробно описывает процедуру трансплантации для субретинальной доставки целых органоидов сетчатки (а не ободков^{органоидов 33,41}) как потенциально лучший способ введения интактных листов сетчатки с PR для увеличения выживаемости трансплантата и улучшения сохранности листа. Несмотря на то, что были разработаны процедуры введения плоского кусочка сетчатки человека, а также пластырей RPE^43,44,45, трансплантация более крупных 3D-трансплантатов не исследовалась. Органоиды сетчатки, полученные из стволовых клеток, являются неисчерпаемым источником фоторецепторных листов для разработки технологий восстановления зрения, свободны от этических ограничений и считаются отличным источником ткани сетчатки человека для терапии, направленной на лечение прогрессирующей РД и терминальной слепоты⁴⁶. Разработка хирургических методов точной субретинальной имплантации органоидов сетчатки с минимальным повреждением ниши сетчатки хозяина (нервная сетчатка, пигментный эпителий сетчатки и сосудистая сеть сетчатки и хориоидеи) является одним из важнейших шагов для продвижения такой терапии к клиническому применению^31,32. Модели крупных животных, таких как кошки, собаки, свиньи и обезьяны, оказались хорошими моделями для исследования хирургических методов доставки, а также для демонстрации безопасности имплантированных листов ткани (клеток пигментного эпителия сетчатки (RPE)) и исследования использования органоидов 41,44,45,47,48,49,50 . Большой глаз животного имеет размер шара, аналогичный человеческому, а также аналогичную анатомию, включая наличие области высокой плотности фоторецепторов, включая колбочки (область centralis), напоминающую человеческую макулу 6,51,52.

В данной рукописи описана методика имплантации ткани сетчатки (органоидов), полученной из hPSC, в субретинальное пространство кошачьих моделей крупных животных (как дикого типа, так и кошек Crx^Rdy/+), что вместе с многообещающими результатами^{эффективности 32,53} создает основу для дальнейшего развития такой исследуемой терапии для клинического применения для лечения состояний РД.