In Vitro Kama Dilimi In Vivo Nöronal Devre Bağlantısı Nın TaklitI Için Hazırlık

Nöral devrelerin aktivitesinin gözlemi ideal olarak doğal duyusal girişler ve geri bildirimler ile gerçekleştirilir, ve beyin bölgeleri arasında sağlam bağlantı, in vivo. Ancak, nöral devre fonksiyonunun tek hücreli çözünürlüğü veren deneylerin gerçekleştirilmesi, bozulmamış beyindeki teknik zorluklarla sınırlıdır. In vivo hücre dışı elektrofizyoloji veya multifoton görüntüleme yöntemleri bozulmamış sinir sistemlerindeki aktiviteyi araştırmak için kullanılabilirken, farklı girdilerin nasıl entegre olduğunu yorumlamak veya eşik altı sinaptik girdileri ölçmek zor olmaya devam etmektedir. In vivo bütün hücre kayıtları bu sınırlamaların üstesinden gelmek ama gerçekleştirmek için zor, kolayca erişilebilen beyin bölgelerinde bile. Tek hücreli çözümlü deneylerin teknik zorlukları, beynin derinliklerinde bulunan bazı nöron popülasyonlarında veya canlı hücreleri bulmak için genetik araçlar gerektiren mekansal olarak dağınık popülasyonlarda (örn. optrode kaydı yla eşleştirilmiş kanaloidofinin genetik ekspresyonu) veya site etiketlemesinden sonra post-hoc histokimyasal tanımlamada (örn. nörotransmisyona özgü belirteçlerle) daha da artırılır. Beyin sapı ventral yüzeyine yakın diffüz bulunan olmak, medial olivocochlear (MOC) nöronlar yukarıdaki sınırlamalar muzdarip¹, onları in vivo deney için erişim son derece zor hale.

Beyin dilimleri (~ 100-500 μm kalınlığı) uzun beyin devreleri çalışmak için kullanılmıştır, işitsel beyin sapı devredahil, aynı dilim içinde bulunan bağlı nöronların fiziksel ayrımı nedeniyle^2,3,4,5,^6,7,^8,9. Çok daha kalın dilimler (>1 mm) kullanarak deneyler, ikili girdilerin medial superior zeytin^10,11dahil olmak üzere üstün olivary kompleksi (SOC) alanlarında nasıl entegre olduğunu anlamak için diğer laboratuvarlarda kullanılmıştır. Bu dilimler, işitsel sinirin aksonlari (AN) dilim içinde bozulmadan kaldı ve cn sinaptik nörotransmitter salınımını başlatmak için elektriksel olarak uyarıldı, ilk derecede işitsel nöronların aktivitesini taklit olarak sese tepki verecekti. Bu kalın dilimlerin en büyük dezavantajlarından biri yama-kelepçe elektrofizyolojik kayıtlar (“yama”) için nöronların görünürlüğüdür. Bu alanda çok sayıda akson yaş 12 ile miyelinated hale olarak Patching giderek daha zor halegelir^13,14,15, doku optik yoğun hale ve tipik bir, ince beyin dilimi bile nöronlar gizleme. Amacımız in vivo kayıtların devre bağlantısına daha çok benzeyen, ancak beyin dilimlerinde görsel güdümlü yama-kelepçe elektrofizyolojisinin yüksek verim ve yüksek çözünürlüklü kayıt yetenekleriyle in vitro preparatlar oluşturmaktır.

Laboratuvarımız, MOC nöronları da dahil olmak üzere işitsel efferent sistemin nöronların fizyolojisini araştırır. Bu kolinerjik nöronlar dış saç hücrelerinin aktivitesini modüle ederek koklea efferent geribildirim sağlamak (OHCs)^{16,17,18,19,20}. Önceki çalışmalar da bu modülasyon koklea²¹,^22,23^,24,25,26 ve akustik travma^{27,28,29,30,31,32,33}de kazanım kontrolü bir rol oynadığını göstermiştir . Farelerde, MOC nöronlar diffüz yamuk vücudun ventral çekirdeğinde yer almaktadır (VNTB) işitsel beyin sapı^1. Grubumuz epifloresan aydınlatma altında beyin sapı dilimleri MOC nöronlar hedef tdTomato muhabiri fare hattı ile geçti ChAT-IRES-Cre fare hattı kullanmıştır. Biz MOC nöronlar trapez vücudun ipsilateral medial çekirdeğinden afferent inhibitör girdi almak gösterdi (MNTB), hangi heyecanlı, sırayla, küresel gür hücrelerden akson tarafından (GBC) kontralateral koklear çekirdeği (CN)^{34,35,36,37,38}. Ayrıca, MOC nöronlar büyük olasılıkla kontralateral CN^39,40,41T-stellat hücrelerinden uyarıcı giriş alırsınız. Birlikte ele alındığında, bu çalışmalar MOC nöronlar aynı (kontralateral) kulak tan türetilen hem uyarıcı ve inhibitör girdileri almak göstermektedir. Ancak, presinaptik nöronlar, ve MOC nöronlar üzerinde yakınsama aksonları, oldukça tipik bir koronal dilim hazırlanmasında tam olarak bozulmamış olması için birbirlerine yeterince yakın değildir. Sinaptik girdilerin MOC nöronlarına entegrasyonunun eylem potansiyeli ateşleme kalıplarını nasıl etkilediğini araştırmak için, yeni tanımlanan inhibisyona odaklanarak, bir kulaktan MOC nöronlarına kadar olan çeşitli afferentleri fizyolojik olarak en gerçekçi şekilde uyarabileceğimiz, ancak in vitro beyin dilimi deneylerinin teknik yararları ile birlikte bir hazırlık geliştirdik.

Kama dilimi, MOC nöronlarında devre entegrasyonunun araştırılması için tasarlanmış değiştirilmiş kalın bir dilim hazırlığıdır (Şekil 1A’daşematize). Dilimin kalın tarafında, kama işitsel sinir kopmuş aksonlar içerir (bundan sonra “işitsel sinir kökü” olarak adlandırılır) onlar CN çevre ve sinaps gelen beyin sapı girerken. İşitsel sinir kökü elektriksel nörotransmitter salınımı ve tamamen bozulmamış CN hücrelerinin sinaptik aktivasyon uyandırmak için uyarılmış olabilir^{42,43,44,45,46}. Bu stimülasyon biçimi devre analizi için çeşitli faydaları vardır. İlk olarak, MOC nöronlarına afferent girdi sağlayan T-stellat ve GBC aksonları doğrudan uyarmak yerine, CN’de bol miktarda bulunan içsel devrelerin aktivasyonuna izin vermek için AN’yi uyarıyoruz. Bu devreler beyin boyunca hedeflerine CN nöronların çıkış modüle, MOC nöronlar dahil^{46,47,48,49,50,51}. İkinci olarak, AN’den MOC nöronlarının CN upstream’ine kadar olan afferent devrelerin polisinetik aktivasyonu, işitsel stimülasyon sırasında in vivo olduğu gibi daha doğal aktivasyon zamanlaması na ve plastisitenin bu sinapslarda oluşmasına olanak sağlar. Üçüncü olarak, an aktivitesini taklit etmek için stimülasyon kalıplarımızı değiştirebiliriz. Son olarak, MOC nöronlar için hem uyarıcı ve inhibitör monaural projeksiyonlar kama dilim bozulmamış, ve bunların entegrasyonu yama-kelepçe elektrofizyoloji hassasiyeti ile bir MOC nöron ölçülebilir. Bir bütün olarak, bu aktivasyon şeması tipik bir beyin dilimi hazırlık ile karşılaştırıldığında MOC nöronlar için daha sağlam bir devre sağlar. Bu beyin sapı kama dilimi de lateral superior zeytin, üstün oliyum çekirdeği ve medial üstün zeytin^{10, 11,52,53,54,55,56}dahil olmak üzere ipsilateral MNTB inhibitör girdi almak diğer işitsel alanları araştırmak için kullanılabilir. Bizim özel hazırlık ötesinde, bu dilimleme yöntemi kullanılabilir veya uzun menzilli girdilerin bağlantı bakımı ve tek hücreli çözünürlükte elektrofizyoloji veya görüntüleme teknikleri çeşitli nöronların görselleştirme iyileştirilmesi yararları ile diğer sistemleri değerlendirmek için değiştirilebilir.

Bu protokol yaklaşık 15 ° yatırılabilir bir vibratom sahne veya platform kullanımını gerektirir. Burada “sahne” bir içbükey manyetik “sahne tabanı yerleştirilir kavisli bir alt ile metal bir disk olduğu bir ticari olarak kullanılabilir 2 parçalı manyetik sahne kullanın.” Daha sonra dilim açısını ayarlamak için aşama kaydırılabilir. Sahne tabanındaki eşmerkezli daireler açıyı tekrarlı olarak tahmin etmek için kullanılır. Sahne ve sahne tabanı dilimleme odasına yerleştirilir, burada manyetik sahne tabanı da döndürülebilir.