In Vitro Wedge Slice Voorbereiding voor het nabootsen van in Vivo Neuronal Circuit Connectiviteit

Observatie van de activiteit van neurale circuits wordt idealiter uitgevoerd met native zintuiglijke ingangen en feedback, en intacte connectiviteit tussen hersengebieden, in vivo. Echter, het uitvoeren van experimenten die eencellige resolutie van neurale circuit functie te geven is nog steeds beperkt door technische uitdagingen in de intacte hersenen. Terwijl in vivo extracellulaire elektrofysiologie of multifoton beeldvormingsmethoden kunnen worden gebruikt voor het onderzoeken van activiteit in intacte zenuwstelsels, blijft het moeilijk om te interpreteren hoe verschillende ingangen integreren of subthreshold synaptische ingangen meten. In vivo hele cel opnames overwinnen deze beperkingen, maar zijn uitdagend uit te voeren, zelfs in hersengebieden die gemakkelijk toegankelijk zijn. Technische uitdagingen van eencellige resolutie experimenten worden verder versterkt in bepaalde neuron populaties die zich diep in de hersenen, of in ruimtelijk diffuse populaties die ofwel genetische instrumenten nodig om cellen te lokaliseren in vivo (bijvoorbeeld genetische expressie van channelrhodopsine in combinatie met optrode opname) of post-hoc histochemische identificatie na opname site etikettering (bijvoorbeeld met neurotransmissie-specifieke markers). Wordt diffuus gelegen in de buurt van het ventrale oppervlak van de hersenstam, mediale olivocochlear (MOC) neuronen lijden aan de bovenstaande beperkingen¹, waardoor ze zeer moeilijk te bereiken voor in vivo experimenten.

Hersensegmenten (~100-500 μm dikte) zijn al lang gebruikt om hersencircuits te bestuderen, inclusief auditieve hersenstamcircuits, vanwege de fysieke segregatie van verbonden neuronen die zich in hetzelfde segment^{2,3,4,5,6,7,8,9}bevinden. Experimenten met veel dikkere plakjes (>1 mm) zijn in andere laboratoria gebruikt om te begrijpen hoe bilaterale ingangen integreren in gebieden van het superieure olivarycomplex (SOC), waaronder de mediale superieure olijf^10,11. Deze plakjes werden zodanig bereid dat axonen van de gehoorzenuw (AN) intact bleven in de slice en werden elektrisch gestimuleerd om synaptische neurotransmitter release in de CN te starten, het nabootsen van activiteit van de eerste orde auditieve neuronen als ze zouden reageren op geluid. Een groot nadeel van deze dikke plakjes is de zichtbaarheid van neuronen voor patch-clamp elektrofysiologische opnames (“patching”). Patchen wordt steeds moeilijker als de vele axonen in dit gebied worden myelinated met de leeftijd^{van 12,13,14,15}, waardoor het weefsel optisch dicht en verduisterend neuronen, zelfs in een typische, dunne hersenen slice. Ons doel is om in vitro preparaten te creëren die meer lijken op de circuitconnectiviteit van in vivo opnames, maar met de hoge doorvoer en hoge-resolutie opnamemogelijkheden van visueel geleide patch-clamp elektrofysiologie in hersensegmenten.

Ons lab onderzoekt de fysiologie van neuronen van het auditieve efferentsysteem, waaronder MOC-neuronen. Deze cholinerge neuronen geven efferent feedback aan het slakkenplaat door de activiteit van buitenste haarcellen (OHC’s)¹⁶,^17,18,19,20te moduleren . Eerdere studies hebben aangetoond dat deze modulatie een rol speelt bij het verkrijgen van controle in het slakkenmiddel^{21,22,23,24,25,26} en bescherming tegen akoestisch trauma^{27,28,29,30,31,32,33}. Bij muizen bevinden MOC-neuronen zich diffuus in de ventrale kern van het trapeziumlichaam (VNTB) in de auditieve hersenstam¹. Onze groep heeft gebruik gemaakt van de ChAT-IRES-Cre muislijn gekruist met de tdTomato reporter muislijn te richten MOC neuronen in hersenstam plakjes onder epifluorescente verlichting. We toonden aan dat MOC-neuronen afferente-remmende input ontvangen van de ipsilaterale mediale kern van het trapeziumlichaam (MNTB), dat op zijn beurt wordt opgewekt door axonen van bolvormige bossige cellen (GBC) in de contralaterale cochleaire kern (CN)^{34,35,36,37,38}. Bovendien ontvangen MOC-neuronen waarschijnlijk hun excitatory input van T-stellate cellen in de contralaterale GN^39,40,41. Samen tonen deze studies aan dat MOC-neuronen zowel excitatory als remmende ingangen ontvangen die zijn afgeleid van hetzelfde (contralaterale) oor. Echter, de presynaptische neuronen, en hun axonen convergerende op MOC neuronen, zijn niet helemaal dicht genoeg bij elkaar om volledig intact in een typische coronale slice voorbereiding. Om te onderzoeken hoe de integratie van synaptische ingangen naar MOC-neuronen hun actiepotentieel beïnvloedt, met een focus op nieuw beschreven remming, ontwikkelden we een preparaat waarin we de diverse afferents naar MOC-neuronen vanuit één oor konden stimuleren op de meest fysiologisch realistische manier mogelijk, maar met de technische voordelen van in vitro brain slice-experimenten.

De wig slice is een gemodificeerde dikke slice voorbereiding ontworpen voor onderzoek van circuit integratie in MOC neuronen (schematized in figuur 1A). Aan de dikke kant van de plak, de wig bevat de afgehakte axonen van de gehoorzenuw (hierna “auditieve zenuwwortel” genoemd) als ze de hersenstam van de periferie en synaps in de CN binnendijzen. De gehoorzenuwwortel kan elektrisch worden gestimuleerd om neurotransmitter-release en synaptische activering van cellen van de volledig intacte GN^{42,43,44,45,46}op te roepen . Dit stimulatieformaat heeft verschillende voordelen voor circuitanalyse. Ten eerste, in plaats van het direct stimuleren van de T-stellate en GBC axonen die afferent input te leveren aan de MOC neuronen, stimuleren we de AN om activering van intrinsieke circuits overvloedig in de CN mogelijk te maken. Deze circuits moduleren de output van CN-neuronen naar hun doelen in de hersenen, waaronder MOC-neuronen^{46,47,48,49,50,51}. Ten tweede, de polysynaptische activering van afferent circuits van de AN via de CN stroomopwaarts van MOC neuronen zorgt voor meer natuurlijke activering timing en voor plasticiteit optreden bij deze synapsen als ze in vivo zou tijdens auditieve stimulatie. Ten derde kunnen we onze stimulatiepatronen variëren om EEN activiteit na te bootsen. Ten slotte zijn zowel excitatory als remmende monaurale projecties voor MOC-neuronen intact in de wigschijf, en hun integratie kan worden gemeten in een MOC-neuron met de precisie van patch-clamp elektrofysiologie. Als geheel, dit activeringsschema biedt een meer intact circuit aan de MOC neuronen in vergelijking met een typische hersenen slice voorbereiding. Deze hersenstam wig slice kan ook worden gebruikt om andere auditieve gebieden die remmende input ontvangen van ipsilaterale MNTB met inbegrip van de laterale superieure olijf, superieure olivary kern en mediale superieure olijf^{10,11,52,53,54,55,56}te onderzoeken . Naast onze specifieke voorbereiding kan deze snijmethode worden gebruikt of aangepast om andere systemen te evalueren met de voordelen van het behoud van connectiviteit van lange-afstandsingangen en het verbeteren van de visualisatie van neuronen voor een verscheidenheid aan eencellige resolutie elektrofysiologie of beeldvormingstechnieken.

Dit protocol vereist het gebruik van een vibratome stage of platform dat ongeveer 15° kan worden gekanteld. Hier gebruiken we een commercieel beschikbare 2-delige magnetische fase waar de “fase” is een metalen schijf met een gebogen bodem geplaatst in een holle magnetische “stage base.” Het stadium kan vervolgens worden verschoven om de segmenthoek aan te passen. Concentrische cirkels op de podiumbasis worden gebruikt om de hoek reproduceerbaar te schatten. Het podium en de trapbasis worden in de snijkamer geplaatst, waar ook de magnetische trapbasis kan worden gedraaid.