في في المختبر إسفين شريحة التحضير لتقليد في اتصال الدائرة العصبية فيفو

يتم تنفيذ مراقبة نشاط الدوائر العصبية بشكل مثالي مع المدخلات الحسية الأصلية والتغذية المرتدة ، والاتصال السليم بين مناطق الدماغ ، في الجسم الحي. ومع ذلك ، فإن إجراء التجارب التي تعطي دقة الخلية الواحدة لوظيفة الدائرة العصبية لا يزال محدودًا بسبب التحديات التقنية في الدماغ السليم. بينما في الجسم الحي خارج الخلية electrophysiology أو طرق التصوير متعددة الصور يمكن استخدامها للتحقيق في النشاط في النظم العصبية سليمة، وتفسير كيفية دمج المدخلات المختلفة أو قياس المدخلات subthreshold متشابك يبقى من الصعب. في تسجيلات الخلية الكاملة في الجسم الحي تتغلب على هذه القيود ولكن تشكل تحديا لأداء، حتى في مناطق الدماغ التي يتم الوصول إليها بسهولة. تتضخم التحديات التقنية لتجارب دقة الخلايا المفردة في بعض مجموعات الخلايا العصبية التي تقع في عمق الدماغ، أو في مجموعات سكانية منتشرة مكانياً تتطلب إما أدوات جينية لتحديد مكان الخلايا في الجسم الحي (على سبيل المثال، التعبير الجيني للقناه البروتوpsين المقترن بتسجيل optrode) أو تحديد الهوية الهستوكيميائية بعد تسجيل العلامات (على سبيل المثال مع علامات خاصة بـ neurotransmission). يجري تقع على نحو منتشر بالقرب من السطح البطني للأدمغة, الخلايا العصبية olivocochlear الوسيط (MOC) تعاني من القيود المذكورة أعلاه^1,مما يجعلها من الصعب للغاية للوصول لفي التجارب الحية.

شرائح الدماغ (~ 100-500 μm سمك) منذ فترة طويلة تستخدم لدراسة دوائر الدماغ، بما في ذلك الدوائر الدماغ السمعية، وذلك بسبب الفصل المادي للخلايا العصبية المتصلة التي ترد داخل نفس شريحة^{2،3،4،5،6،7،8،9}. وقد استخدمت التجارب باستخدام شرائح أكثر سمكا بكثير (> 1 ملم) في مختبرات أخرى لفهم كيفية دمج المدخلات الثنائية في مناطق مجمع أوليفاري متفوقة (SOC) بما في ذلك الزيتون متفوقة الوسيط^10،11. تم إعداد هذه الشرائح بحيث أن محاور عصبية من العصب السمعي (AN) ظلت سليمة داخل شريحة وحفزت كهربائيا لبدء إطلاق الناقل العصبي متشابك في CN, محاكاة نشاط الخلايا العصبية السمعية من الدرجة الأولى لأنها سوف تستجيب للصوت. عيب رئيسي واحد من هذه الشرائح سميكة هو رؤية الخلايا العصبية للتسجيلات الكهربائية التضيق المشبك (“الترقيع”). يصبح التصحيح صعبة بشكل متزايد كما تصبح محاور عصبية عديدة في هذا المجال النخاعي مع سن^12,13,14,15, مما يجعل الأنسجة الخلايا العصبية الكثيفة بصريا وحجب حتى في نموذجي, شريحة الدماغ رقيقة. هدفنا هو خلق في تجهيزات في المختبر التي تشبه بشكل أوثق اتصال الدائرة في تسجيلات الجسم الحي، ولكن مع قدرات عالية الإنتاجية وتسجيل عالية الدقة من البصرية توجيه التصحيح المشبك الكهربائية الفيزيولوجيا في شرائح الدماغ.

مختبرنا يحقق في فسيولوجيا الخلايا العصبية في النظام السمعي الـإفرازي، بما في ذلك الخلايا العصبية MOC. هذه الخلايا العصبية الكولينية تقديم ردود الفعل efferent إلى قوقعة الأذن عن طريق تحوير نشاط خلايا الشعر الخارجي (OHCs)^{16,17,18,19,20}. وقد أظهرت الدراسات السابقة أن هذا التشكيل يلعب دوراً في السيطرة على القوقعة^{21،22،23،24،25،26} والحماية من الصدمة الصوتية^{27،28،29،30،31،32،33}. في الفئران، تقع الخلايا العصبية MOC منتشر في النواة البطنية من الجسم شبه المنحرف (VNTB) في الدماغ السمعي¹. وقد استخدمت مجموعتنا خط الماوس ChAT-IRES-Cre عبر مع خط الماوس مراسل tdTomato لاستهداف الخلايا العصبية MOC في شرائح جذع الدماغ تحت الإضاءة الظهارة. أظهرنا أن الخلايا العصبية MOC تلقي مدخلات مثبطة afferent من نواة الوسيطة ipsilateral من الجسم شبه المنحرف (MNTB)، وهو متحمس، بدوره، من قبل محاور عصبية من الخلايا شجيرة كروية (GBC) في نواة القوقعة contralateral (CN)^{34،35،36،38}. بالإضافة إلى ذلك, الخلايا العصبية MOC من المرجح تلقي مدخلاتها استثارة من الخلايا التي تى-ممتاز في الـ CN contralateralral^39,40,41. معا، وتظهر هذه الدراسات الخلايا العصبية MOC تلقي كل من المدخلات الإثارة والمثبطة المستمدة من نفس الأذن (contralateralral). ومع ذلك، فإن الخلايا العصبية presynaptic، ومحور عصبيتها تتلاقى على الخلايا العصبية MOC، ليست قريبة جدا بما فيه الكفاية لبعضها البعض لتكون سليمة تماما في إعداد شريحة الإكلالية نموذجية. للتحقيق في كيفية دمج المدخلات متشابك لالخلايا العصبية MOC يؤثر على أنماط إطلاق النار المحتملة عملهم، مع التركيز على تثبيط وصفها حديثا، وضعنا إعداد التي يمكن أن تحفز afferents متنوعة إلى الخلايا العصبية MOC من أذن واحدة في الطريقة الأكثر واقعية من الناحية الفسيولوجية ممكن، ولكن مع الفوائد التقنية لتجارب شريحة الدماغ في المختبر.

شريحة إسفين هو إعداد شريحة سميكة معدلة مصممة للتحقيق في التكامل الدائرة في الخلايا العصبية MOC (المخطط في الشكل 1A). على الجانب السميك من الشريحة، يحتوي الإسفين على المحاور الحادة للأعصاب السمعية (التي يطلق عليها “جذر العصب السمعي” فيما بعد) عند دخولها جذع الدماغ من المحيط والمشابك في النفثالين. يمكن تحفيز جذر العصب السمعي كهربائيا لاستحضار الافراج عن الناقل العصبي وتفعيل متشابك من الخلايا من CN سليمة تماما^{42،43،44،45،46}. هذا الشكل التحفيز له العديد من الفوائد لتحليل الدائرة. أولا، بدلا من تحفيز مباشرة من المحاور T-ممتاز و GBC التي توفر مدخلات من الداخل إلى الخلايا العصبية MOC، ونحن نحفز AN للسماح لتنشيط الدوائر الجوهرية وفيرة في CN. هذه الدوائر تعدل انتاج الخلايا العصبية CN لأهدافها في جميع أنحاء الدماغ، بما في ذلك الخلايا العصبية MOC^{46،47،48،49،50،51}. ثانيا، التنشيط polysynaptic من الدوائر afferent من AN من خلال المنبع CN من الخلايا العصبية MOC يسمح لتوقيت التنشيط أكثر طبيعية ولدونة أن يحدث في هذه نقاط الاشتباك العصبي كما يفعلون في الجسم الحي خلال التحفيز السمعي. ثالثاً، يمكننا أن نختلف أنماط التحفيز لدينا لمحاكاة نشاط AN. وأخيرا، كل من الإسقاطات الإثارة والمثبطة إلى الخلايا العصبية MOC سليمة في شريحة إسفين، ويمكن قياس تكاملها في الخلايا العصبية MOC مع دقة الفيزيولوجيا الكهربائية التصحيح المشبك. ككل، يوفر هذا المخطط التنشيط دائرة أكثر سلامة إلى الخلايا العصبية MOC مقارنة بإعداد شريحة الدماغ نموذجية. ويمكن أيضا أن تستخدم هذه الشريحة إسفين جذع الدماغ للتحقيق في المناطق السمعية الأخرى التي تتلقى مدخلات المثبطة من IPSilateral MNTB بما في ذلك الزيتون الجانبي متفوقة، نواة أوليفاري متفوقة والزيتون متفوقة وسيطة^{10،11،52،53،54،55،56}. أبعد من إعدادنا محددة، يمكن استخدام هذه الطريقة تشريح أو تعديل لتقييم أنظمة أخرى مع فوائد الحفاظ على الاتصال من المدخلات طويلة المدى وتحسين التصور من الخلايا العصبية لمجموعة متنوعة من الخلايا وحيدة الدقة الكهربائية أو تقنيات التصوير.

يتطلب هذا البروتوكول استخدام مرحلة هزاز أو منصة يمكن إمالة حوالي 15 درجة. هنا نستخدم مرحلة مغناطيسية متاحة تجاريا 2 قطعة حيث “المرحلة” هو قرص معدني مع أسفل منحني وضعت في “قاعدة مرحلة المرحلة” مقعرة المغناطيسي. يمكن بعد ذلك أن يتم نقل المرحلة لضبط زاوية الشريحة. وتستخدم الدوائر متحدة المركز على قاعدة المرحلة لتقدير زاوية reproducibly. يتم وضع مرحلة وقاعدة المرحلة في غرفة تشريح، حيث يمكن أيضا قاعدة المرحلة المغناطيسية يمكن أن تكون استدارة.