במבחנה טריז פרוסה הכנה עבור חיקוי בקישוריות מעגל עצבי Vivo

תצפית על פעילות של מעגלים עצביים מבוצעת באופן אידיאלי עם תשומות חושיות ומשוב מקוריים, וקישוריות שלמה בין אזורי המוח, ב vivo. עם זאת, ביצוע ניסויים הנותנים רזולוציה של תא יחיד של תפקוד מעגל עצבי עדיין מוגבל על ידי אתגרים טכניים במוח שלם. בעוד ב-vivo אלקטרופיזיולוגיה חוץ תאית או שיטות הדמיה multiphoton יכול לשמש לחקירת פעילות במערכות עצבים שלמות, לפרש כיצד תשומות שונות לשלב או מדידה תשומות סינפטיות subthreshold נשאר קשה. בהקלטות vivo תא שלם להתגבר על מגבלות אלה, אבל הם מאתגרים לבצע, אפילו באזורים במוח אשר נגישים בקלות. אתגרים טכניים של ניסויים ברזולוציה של תא יחיד מוגברים עוד יותר באוכלוסיות נוירון מסוימות הממוקמות עמוק במוח, או באוכלוסיות מפוזרות מרחבית הדורשות כלים גנטיים כדי לאתר תאים ב-vivo (למשל, ביטוי גנטי של channelrhodopsin בשילוב עם הקלטת optrode) או זיהוי היסטוכימי פוסט הוק לאחר תיוג אתר הקלטה (למשל עם סמנים ספציפיים לנוירוטרנסמיט). להיות ממוקם באופן מפוזר ליד פני השטח החנונים של גזע המוח, נוירונים olivocochlear מדיאלי (MOC) סובלים מהמגבלות לעיל^{1, מה שהופך אותם קשה}מאוד לגשת לניסויים vivo.

פרוסות מוח (~ 100-500 μm עובי) שימשו זמן רב כדי ללמוד מעגלים במוח, כולל מעגלים גזע המוח השמיעתי, בשל ההפרדה הפיזית של נוירונים מחוברים הכלולים^{בתוך אותה פרוסה 2,3,4,5,6,7,8,9}. ניסויים באמצעות פרוסות עבות הרבה יותר (>1 מ”מ) הועסקו במעבדות אחרות כדי להבין כיצד תשומות דו-צדדיות משתלבות באזורים של קומפלקס אוליברי מעולה (SOC) כולל זית^{מעולה מדיאלי 10,11}. פרוסות אלה הוכנו כך כי האקסונים של עצב השמיעה (AN) נשאר שלם בתוך הפרוסה היו מגורה חשמלית ליזום שחרור מוליך עצבי סינפטי ב CN, מחקה פעילות של נוירונים שמיעתיים סדר ראשון כפי שהם יגיבו לקול. אחד החיסרון העיקרי של פרוסות עבות אלה הוא ניראות של נוירונים עבור הקלטות אלקטרופיזיולוגיות תיקון-מהדק (“תיקון”). תיקון הופך קשה יותר ויותר כמו האקסונים הרבים באזור זה הופכים מילינציה עם גיל^12,13 ,^14,15,מה^שהופךאת הרקמה צפופה אופטית וסמיך נוירונים אפילו בפרוסת מוח טיפוסית, דקה. המטרה שלנו היא ליצור בהכנות מבחנה הדומות יותר לקישוריות המעגל של הקלטות vivo, אבל עם תפוקה גבוהה ויכולות הקלטה ברזולוציה גבוהה של אלקטרופיזיולוגיה מדבקה מונחית חזותית לפרוסות מוח.

המעבדה שלנו חוקרת את הפיזיולוגיה של תאי העצב של מערכת אפרטשמיעתית, כולל נוירונים MOC. נוירונים כולינרגית אלה מספקים משוב אדיש לשבלול על ידי לווסת את הפעילות של תאי שיער בחוץ (OHCs)^{16,17,18,19,20}. מחקרים קודמים הראו כי אפנון זה ממלא תפקיד בהשיג^{שליטה בשבלול 21},^{22,23,24,25,26} והגנה^{מפני טראומה אקוסטית 27},^{28,29,30,31,32,33}. בעכברים, נוירונים MOC ממוקמים באופן מפוזר בגרעין הפתח של גוף הטרפז (VNTB) בגזע המוח^{השמיעתי 1}. הקבוצה שלנו השתמשה בקו העכבר ChAT-IRES-Cre חצה עם קו העכבר כתב tdTomato למקד נוירונים MOC בפרוסות גזע המוח תחת תאורה אפיפלואורסצנטית. הראינו כי נוירונים MOC לקבל קלט מעכב אפיל מן הגרעין המדיואלי ipsilateral של גוף טרפז (MNTB), אשר נרגש, בתורו, על ידי אקסונים מתאים סבוך כדורי (GBC) בגרעין השבלול הניטרי (CN)^{34, 35,36,37,38}. בנוסף, נוירונים MOC סביר לקבל קלט מעורר שלהם מתאי T-stellate ב CN^{39 ההתפלהההתפלה ,40,41}. יחד, מחקרים אלה מראים נוירונים MOC לקבל הן תשומות מעוררות ומעכבות נגזר מאותה (קונטרה חוץ) אוזן. עם זאת, הנוירונים presynaptic, ואת האקסונים שלהם מתכנסים על נוירונים MOC, הם לא ממש קרובים זה לזה כדי להיות שלמים לחלוטין בהכנה פרוסת קורונל טיפוסית. כדי לחקור כיצד שילוב של תשומות סינפטיות לנוירונים MOC משפיע על דפוסי ירי פוטנציאליים הפעולה שלהם, עם דגש על עיכוב שתואר לאחרונה, פיתחנו הכנה שבה אנו יכולים לעורר את אפרטנטים מגוונים לנוירונים MOC מאוזן אחת בדרך הפיזיולוגית ביותר מציאותית האפשרית, אבל עם היתרונות הטכניים של ניסויי פרוסת מוח במבחנה.

פרוסת הטריז היא הכנת פרוסה עבה שונה שנועדה לחקירה של שילוב מעגלים בנוירונים MOC (ממוכמת בדמות 1A). בצד העבה של הפרוסה, הטריז מכיל את האקסונים הקותעים של עצב השמיעה (בשם “שורש עצב שמיעתי” להלן) כשהם נכנסים לגזע המוח מהפריפריה ולסינאפסה ב-CN. שורש העצב השמיעתי יכול להיות מגורה חשמלית כדי לעורר שחרור מוליך עצבי והפעלה סינפטית של תאים של CN⁴²שלם^{לחלוטין,43,44,45,46}. תבנית גירוי זו כוללת מספר יתרונות לניתוח מעגלים. ראשית, במקום לגרות ישירות את האקסונים T-stellate ו GBC המספקים קלט אדיש לנוירונים MOC, אנו לעורר את AN כדי לאפשר הפעלה של מעגלים פנימיים בשפע ב CN. מעגלים אלה לווסת את התפוקה של נוירונים CN ליעדים שלהם ברחבי המוח, כולל נוירונים MOC^{46,47,48,49,50,51}. שנית, ההפעלה polysynaptic של מעגלים אפילים מן AN דרך CN במעלה הזרם של נוירונים MOC מאפשר תזמון הפעלה טבעי יותר עבור פלסטיות להתרחש בסינפסות אלה כפי שהם היו vivo במהלך גירוי שמיעתי. שלישית, אנחנו יכולים לשנות את דפוסי הגירוי שלנו כדי לחקות פעילות AN. לבסוף, הן תחזיות מונוארות מעוררות ומעכבות לנוירונים MOC הם שלמים פרוסת טריז, ואת השילוב שלהם ניתן למדוד בנוירון MOC עם הדיוק של אלקטרופיזיולוגיה טלאי-מהדק. ככלל, ערכת הפעלה זו מספקת מעגל שלם יותר לנוירונים MOC בהשוואה הכנה פרוסת מוח טיפוסית. פרוסת טריז גזע המוח זה יכול לשמש גם כדי לחקור אזורים שמיעתיים אחרים אשר מקבלים קלט מעכב מ-MNTB ipsilateral כולל זית מעולה לחוץ, גרעין אוליברי^{מעולה וזית מעולה}מדיאלי 10^{,11,52,53,54,55,56}. מעבר להכנה הספציפית שלנו, ניתן להשתמש בשיטת חיתוך זו או לשנות כדי להעריך מערכות אחרות עם היתרונות של שמירה על קישוריות של תשומות ארוכות טווח ושיפור החזותיה של נוירונים עבור מגוון רחב של אלקטרופיזיולוגיה ברזולוציה חד-תאית או טכניקות הדמיה.

פרוטוקול זה דורש שימוש בשלב או בפלטפורמה של vibratome שניתן להטות כ- 15°. כאן אנו משתמשים בשלב מגנטי זמין מסחרית של שני חלקים שבו ה”במה” הוא דיסק מתכת עם תחתית מעוקלת הממוקמת ב”בסיס במה” מגנטי קעור. לאחר מכן ניתן להזיז את השלב כדי להתאים את זווית הפרוסה. עיגולים קונצנטריים בבסיס הבמה משמשים להערכת הזווית באופן רפרודוקטיבי. בסיס הבמה והשלב ממוקמים בתא החיתוך, שם ניתן גם לסובב את בסיס הבמה המגנטית.