Preparação de fatia de cunha in vitro para imitar conectividade do circuito neuronal vivo

A observação da atividade dos circuitos neurais é idealmente realizada com entradas sensoriais nativas e feedback, e conectividade intacta entre regiões cerebrais, in vivo. No entanto, a realização de experimentos que dão resolução unicelular da função do circuito neural ainda é limitada por desafios técnicos no cérebro intacto. Enquanto métodos de eletrofisiologia extracelular in vivo ou imagens multifotográficas podem ser usados para investigar a atividade em sistemas nervosos intactos, interpretar como diferentes insumos se integram ou medem entradas sinápticas subestresis permanecem difíceis. Gravações in vivo de células inteiras superam essas limitações, mas são desafiadoras de realizar, mesmo em regiões cerebrais que são facilmente acessadas. Os desafios técnicos dos experimentos de resolução unicelular são ainda mais amplificados em certas populações de neurônios que estão localizadas nas profundezas do cérebro, ou em populações espacialmente difusas que requerem ferramentas genéticas para localizar células in vivo (por exemplo, expressão genética de channelrhodopsin emparelhada com gravação optrode) ou identificação histoquímica pós-hoc após a gravação do local (por exemplo, com marcadores específicos de neurotransmissão). Estando localizados difusamente perto da superfície ventral do tronco cerebral, os neurônios olivococleares medial (MOC) sofrem das limitações acima¹, tornando-os extremamente difíceis de acessar para experimentação in vivo.

As fatias cerebrais (~100-500 μm de espessura) têm sido usadas há muito tempo para estudar circuitos cerebrais, incluindo circuitos de tronco cerebral auditivo, devido à segregação física de neurônios conectados que estão contidos dentro da mesma fatia^{2,3,4,5,6,7,8,9}. Experimentos com fatias muito mais grossas (>1 mm) têm sido empregados em outros laboratórios para entender como os insumos bilaterais se integram em áreas do complexo olivary superior (SOC), incluindo a azeitona superior medial^10,11. Estas fatias foram preparadas de tal forma que os axônios do nervo auditivo (AN) permaneceram intactos dentro da fatia e foram eletricamente estimulados a iniciar a liberação de neurotransmissores sinápticos no CN, imitando a atividade dos neurônios auditivos de primeira ordem como eles responderiam ao som. Uma grande desvantagem dessas fatias grossas é a visibilidade dos neurônios para gravações eletrofisiológicas de grampo de remendo (“patching”). A remenda torna-se cada vez mais difícil à medida que os numerosos axônios nesta área tornam-se mieliados com^12,13,14,15anos, tornando o tecido opticamente denso e obscurecendo neurônios mesmo em uma típica fatia cerebral fina. Nosso objetivo é criar preparações in vitro que se assemelham mais à conectividade do circuito de gravações in vivo, mas com as habilidades de gravação de alta produtividade e alta resolução da eletrofisiologia de grampos visualmente guiados em fatias cerebrais.

Nosso laboratório investiga a fisiologia dos neurônios do sistema auditivo e diferente, incluindo neurônios MOC. Estes neurônios colinérgicos fornecem feedback eferente à cóclea, modulando a atividade das células ciliares externas (OHCs)^{16,17,18,19,20}. Estudos anteriores mostraram que essa modulação desempenha um papel no controle de ganhos na cóclea^{21,22,23,24,25,26} e proteção contra trauma acústico^{27,28,29,30,31,32,33}. Em camundongos, os neurônios MOC estão divididos no núcleo ventral do corpo trapezoide (VNTB) no tronco cerebral auditivo¹. Nosso grupo utilizou a linha de mouse ChAT-IRES-Cre cruzada com a linha de rato repórter tdTomato para atingir neurônios MOC em fatias de tronco cerebral sob iluminação epifluorescente. Mostramos que os neurônios MOC recebem uma entrada inibitória diferente do núcleo medial ipsilateral do corpo trapezoide (MNTB), que é animado, por sua vez, por axônios de células espessas globulares (GBC) no núcleo coclear contralateral (CN)^{34,35,36,37,38}. Além disso, os neurônios MOC provavelmente recebem sua entrada excitatória de células T-estelares no CN^39,40,41. Juntos, esses estudos mostram que os neurônios MOC recebem insumos excitatórios e inibitórios derivados do mesmo ouvido (contralateral). No entanto, os neurônios pré-sinápticos, e seus axônios convergindo em neurônios MOC, não são suficientemente próximos um do outro para estarem totalmente intactos em uma típica preparação de fatias coronais. Para investigar como a integração de entradas sinápticas aos neurônios MOC afeta seus padrões potenciais de ação, com foco na inibição recém-descrita, desenvolvemos uma preparação na qual poderíamos estimular os diversos afferents aos neurônios MOC de um ouvido da maneira mais fisiologicamente realista possível, mas com os benefícios técnicos de experimentos in vitro de fatias cerebrais.

A fatia de cunha é uma preparação de fatia grossa modificada projetada para a investigação da integração do circuito em neurônios MOC (esquematizado na Figura 1A). No lado grosso da fatia, a cunha contém os axônios decepados do nervo auditivo (denominado “raiz nervosa auditiva” daqui em diante) à medida que entram no tronco cerebral da periferia e da sinapse no CN. A raiz nervosa auditiva pode ser estimulada eletricamente para evocar a liberação de neurotransmissores e a ativação sináptica das células do CN^{42,43,44,45,46}. Este formato de estimulação tem vários benefícios para a análise do circuito. Primeiro, em vez de estimular diretamente os axônios T-stellate e GBC que fornecem uma entrada diferente aos neurônios MOC, estimulamos o AN para permitir a ativação de circuitos intrínsecos abundantes no CN. Esses circuitos modulam a saída de neurônios CN para seus alvos em todo o cérebro, incluindo neurônios MOC^{46,47,48,49,50,51}. Em segundo lugar, a ativação polissináptica de circuitos diferentes do AN através do a montante CN dos neurônios MOC permite que um tempo de ativação mais natural e para a plasticidade ocorra nessas sinapses como ocorreriam in vivo durante a estimulação auditiva. Terceiro, podemos variar nossos padrões de estimulação para imitar uma atividade. Finalmente, tanto as projeções monaural excitatórias quanto inibitórias para os neurônios MOC estão intactas na fatia da cunha, e sua integração pode ser medida em um neurônio MOC com a precisão da eletrofisiologia de grampo de remendo. Como um todo, este esquema de ativação fornece um circuito mais intacto para os neurônios MOC em comparação com uma preparação típica de fatia cerebral. Esta fatia de cunha do tronco cerebral também pode ser usada para investigar outras áreas auditivas que recebem insumos inibitórios do MNTB ipsilateral, incluindo a azeitona superior lateral, o núcleo olivary superior e a azeitona superior medial^{10,11,52,53,54,55,56}. Além de nossa preparação específica, este método de corte pode ser usado ou modificado para avaliar outros sistemas com os benefícios de manter a conectividade de entradas de longo alcance e melhorar a visualização de neurônios para uma variedade de técnicas de eletrofisiologia de resolução unicelular ou de imagem.

Este protocolo requer o uso de um estágio ou plataforma vibratome que pode ser inclinado aproximadamente 15°. Aqui usamos um estágio magnético de 2 peças comercialmente disponível onde o “palco” é um disco de metal com um fundo curvo colocado em uma “base de estágio” magnética côncava. O estágio pode então ser deslocado para ajustar o ângulo da fatia. Círculos concêntricos na base do palco são usados para estimar o ângulo de forma reprodutível. O estágio e a base do palco são colocados na câmara de corte, onde a base do estágio magnético também pode ser girada.