Summary

Preparazione della fetta di cuneo in vitro per imitare la connettività del circuito neuronale in vivo

Published: August 18, 2020
doi:

Summary

L’integrazione di diversi input sinaptici ai neuroni è meglio misurata in una preparazione che preserva tutti i nuclei pre-sinaptici per la tempismo naturale e la plasticità del circuito, ma le fette cerebrali in genere tagliano molte connessioni. Abbiamo sviluppato una fetta cerebrale modificata per imitare l’attività del circuito in vivo mantenendo la capacità di sperimentazione in vitro.

Abstract

Le tecniche di elettrofisiologia a fette in vitro misurano l’attività a singola cellula con una precisa risoluzione elettrica e temporale. Le fette cerebrali devono essere relativamente sottili per visualizzare e accedere correttamente ai neuroni per il bloccaggio delle patch o l’imaging, e l’esame in vitro dei circuiti cerebrali è limitato solo a ciò che è fisicamente presente nella fetta acuta. Per mantenere i benefici della sperimentazione di fette in vitro preservando una porzione maggiore di nuclei presnaptici, abbiamo sviluppato una nuova preparazione di fette. Questa “fetta di cuneo” è stata progettata per le registrazioni di elettrofisiologia patch-clamp per caratterizzare i diversi input monaurali e sound-driven ai neuroni olivocochlear mediali (MOC) nel tronco encefalico. Questi neuroni ricevono i loro input eccitatori e inibitori afferenti primari dai neuroni attivati dagli stimoli nell’orecchio contralaterale e dal corrispondente nucleo cocleare (CN). È stata progettata una fetta cerebrale asimmetrica che è più spessa nel dominio rostro-caudale sul bordo laterale di un emisfero e poi si assottiglia verso il bordo laterale dell’emisfero opposto. Questa fetta contiene, sul lato spesso, la radice nervosa uditiva che trasmette informazioni sugli stimoli uditivi al cervello, sui circuiti NC intrinseci e sia sulle vie afferenti inibitorie disinaptiche che trisintottiche che convergono sui neuroni MOC contralaterali. La registrazione viene eseguita dai neuroni MOC sul lato sottile della fetta, dove vengono visualizzati utilizzando l’ottica DIC per tipici esperimenti patch-clamp. La stimolazione diretta del nervo uditivo viene eseguita mentre entra nel tronco uditivo, consentendo l’attività intrinseca del circuito CN e la plasticità sinaptica a sinapsi a monte dei neuroni MOC. Con questa tecnica, si può imitare l’attivazione del circuito in vivo il più vicino possibile all’interno della fetta. Questa preparazione della fetta di cuneo è applicabile ad altri circuiti cerebrali in cui le analisi dei circuiti beneficeranno della conservazione della connettività a monte e degli input a lungo raggio, in combinazione con i vantaggi tecnici della fisiologia delle fette in vitro.

Introduction

L’osservazione dell’attività dei circuiti neurali viene eseguita idealmente con input sensoriali e feedback nativi e connettività intatta tra le regioni cerebrali, in vivo. Tuttavia, l’esecuzione di esperimenti che danno una risoluzione a una cellula della funzione del circuito neurale è ancora limitata da sfide tecniche nel cervello intatto. Mentre l’elettrofisiologia extracellulare in vivo o i metodi di imaging multifotonica possono essere utilizzati per studiare l’attività in sistemi nervosi intatti, interpretare come diversi input integrino o misurino gli input sinaptici sottosoglie rimane difficile. Le registrazioni intere cellulari in vivo superano questi limiti ma sono difficili da eseguire, anche nelle regioni cerebrali facilmente accessibili. Le sfide tecniche degli esperimenti di risoluzione a singola cellula sono ulteriormente amplificate in alcune popolazioni neuronali che si trovano in profondità nel cervello, o in popolazioni spazialmente diffuse che richiedono strumenti genetici per localizzare le cellule in vivo (ad esempio, espressione genetica della channelrhodopsina abbinata alla registrazione optrode) o identificazione istochimica post-hoc dopo la registrazione dell’etichettatura del sito (ad esempio con marcatori specifici della neurotrasmissione). Essendo situati diffusamente vicino alla superficie ventrale del tronco encefalico, i neuroni olivocochlear mediali (MOC) soffrono dei limiti di cuisopra 1,rendendoli estremamente difficili da accedere per la sperimentazione in vivo.

Le fette cerebrali (~100-500 μm di spessore) sono state a lungo utilizzate per studiare i circuiti cerebrali, compresi i circuiti uditivi del tronco encefalico, a causa della segregazione fisica dei neuroni collegati che sono contenuti all’interno dellastessa fetta 2,3,4,5,6,7,8,9. Esperimenti che utilizzano fette molto più spesse (>1 mm) sono stati impiegati in altri laboratori per capire come gli input bilaterali si integrano nelle aree del complesso olivario superiore (SOC) tra cui l’oliva medialesuperiore 10,11. Queste fette sono state preparate in modo tale che gli assoni del nervo uditivo (AN) sono rimasti intatti all’interno della fetta e sono stati stimolati elettricamente ad avviare il rilascio di neurotrasmettitori sinaptici nel CN, imitando l’attività dei neuroni uditivi di primo ordine mentre rispondevano al suono. Uno dei principali svantaggi di queste fette spesse è la visibilità dei neuroni per le registrazioni elettrofisiofisioche patch-clamp (“patching”). L’applicazione di patch diventa sempre più difficile man mano che i numerosi assoni in quest’area si mielivano conl’età di 12,13,14,15anni, rendendo il tessuto otticamente denso e oscurando i neuroni anche in una tipica, sottile fetta cerebrale. Il nostro obiettivo è quello di creare preparati in vitro che assomiglino più strettamente alla connettività del circuito delle registrazioni in vivo, ma con le capacità di registrazione ad alta produttività e ad alta risoluzione dell’elettrofisiologia patch-clamp guidata visivamente nelle fette cerebrali.

Il nostro laboratorio studia la fisiologia dei neuroni del sistema efferente uditivo, compresi i neuroni MOC. Questi neuroni colinergici forniscono un feedback efferente alla coclea modulando l’attività delle cellule ciliate esterne (OHC)16,17,18,19,20. Studi precedenti hanno dimostrato che questa modulazione gioca un ruolo nel controllo del guadagno nella cochlea21,22,23,24,25,26 e protezione dal trauma acustico27,28,29,30,31,32,33. Nei topi, i neuroni MOC si trovano diffusamente nel nucleo ventrale del corpo trapezoiato (VNTB) nel tronco uditivo1. Il nostro gruppo ha utilizzato la linea di topi ChAT-IRES-Cre incrociata con la linea del mouse tdTomato reporter per colpire i neuroni MOC in fette di tronco encefalico sotto illuminazione epifluorescente. Abbiamo dimostrato che i neuroni MOC ricevono un input inibitoriofferente dal nucleo mediale ipsilaterale del corpo trapezoiato (MNTB), che è eccitato, a sua volta, dagli assoni delle cellule folte globulari (GBC) nel nucleo cocleare conlaterale (CN)34,35,36,37,38. Inoltre, i neuroni MOC probabilmente ricevono il loro input eccitatorio dalle cellule T-stellate nel contralaterale CN39,40,41. Nel loro insieme, questi studi mostrano che i neuroni MOC ricevono sia input eccitatori che inibitori derivati dallo stesso orecchio (contralaterale). Tuttavia, i neuroni presnaptici, e i loro assoni che convergono sui neuroni MOC, non sono abbastanza vicini l’uno all’altro per essere completamente intatti in una tipica preparazione delle fette coronali. Per indagare come l’integrazione degli input sinaptici ai neuroni MOC influenzi i loro potenziali schemi di fuoco d’azione, con particolare attenzione all’inibizione appena descritta, abbiamo sviluppato una preparazione in cui potremmo stimolare i diversi afferenti ai neuroni MOC da un orecchio nel modo più fisiologicamente realistico possibile, ma con i benefici tecnici degli esperimenti in vitro sulle fette cerebrali.

La fetta di cuneo è una preparazione di fette spesse modificata progettata per lo studio dell’integrazione del circuito nei neuroni MOC (schematizzata nella figura 1A). Sul lato spesso della fetta, il cuneo contiene gli assoni mozzati del nervo uditivo (chiamato “radice nervosa uditivo” di seguito) mentre entrano nel tronco encefalico dalla periferia e dalla sinapsi nel CN. La radice nervosa uditivo può essere stimolata elettricamente per evocare il rilascio di neurotrasmettitori e l’attivazione sinaptica delle cellule del CN42completamenteintatto,43,44,45,46. Questo formato di stimolazione ha diversi vantaggi per l’analisi del circuito. In primo luogo, invece di stimolare direttamente gli assoni T-stellati e GBC che forniscono un input afferente ai neuroni MOC, stimoliamo l’AN per consentire l’attivazione di circuiti intrinseci abbondanti nel CN. Questi circuiti modulano l’uscita dei neuroni CN ai loro obiettivi in tutto il cervello, compresi i neuroni MOC46,47,48,49,50,51. In secondo luogo, l’attivazione polisinaptica di circuiti afferenti dall’AN attraverso il CN a monte dei neuroni MOC consente tempi di attivazione più naturali e la plasticità a queste sinapsi come sarebbero in vivo durante la stimolazione uditivo. In terzo luogo, possiamo variare i nostri modelli di stimolazione per imitare l’attività AN. Infine, sia le proiezioni monoali eccitatorie che inibitorie ai neuroni MOC sono intatte nella fetta di cuneo e la loro integrazione può essere misurata su un neurone MOC con la precisione dell’elettrofisiologia patch-clamp. Nel complesso, questo schema di attivazione fornisce un circuito più intatto ai neuroni MOC rispetto a una tipica preparazione delle fette cerebrali. Questa fetta di cuneo del tronco encefalico può anche essere utilizzata per indagare altre aree uditivi che ricevono input inibitori da MNTB ipsilaterale tra cui l’oliva superiore laterale, il nucleo olivario superiore e l’oliva superiore mediale10,11,52,53,54,55,56. Oltre alla nostra preparazione specifica, questo metodo di affezione può essere utilizzato o modificato per valutare altri sistemi con i vantaggi di mantenere la connettività degli input a lungo raggio e migliorare la visualizzazione dei neuroni per una varietà di tecniche di elettrofisiologia o imaging a risoluzione a singola cellula.

Questo protocollo richiede l’uso di uno stadio o di una piattaforma del vibratomo che può essere inclinato di circa 15°. Qui usiamo uno stadio magnetico a 2 pezzi disponibile in commercio in cui lo “stadio” è un disco metallico con un fondo curvo posto in una “base dello stadio” magnetica concava. Il palco può quindi essere spostato per regolare l’angolo della fetta. I cerchi concentrici sulla base dello stadio vengono utilizzati per stimare l’angolo in modo riproducibile. La base dello stadio e dello stadio è posizionata nella camera di affezione, dove può anche essere ruotata la base dello stadio magnetico.

Protocol

Tutte le procedure sperimentali sono state approvate dal National Institute of Neurological Disorders and Stroke/National Institute on Deafness and Other Communication Disorders Animal Care and Use Committee. 1. Preparazioni sperimentali NOTA: I dettagli relativi alla preparazione delle fette, tra cui la soluzione di affettare, la temperatura di affezione, la temperatura e l’apparato di incubazione delle fette (ecc.) sono specifici per la preparazione del tronco encef…

Representative Results

Esame istologico della fetta di cuneoPer la nostra indagine sulla funzione neuronale del tronco encefalico uditivo, la preparazione della fetta di cuneo è stata progettata per contenere la radice nervosa uditivo e il contralaterale CN ai neuroni MOC destinati alle registrazioni (fetta di esempio mostrata nella figura 1B). L’esame istologico iniziale del preparato è importante per confermare che la fetta contiene i nuclei necessari per l’attivazione del circuito e che l…

Discussion

La procedura di affettare qui descritta come una fetta di cuneo è potente per mantenere intatti circuiti neuronali presnaptici, ma con l’accessibilità della sperimentazione della fetta cerebrale per l’analisi della funzione neuronale. Occorre fare molta attenzione in diversi passaggi iniziali al fine di massimizzare l’utilità della preparazione per l’analisi del circuito. Le dimensioni del cuneo devono essere confermate mediante esame istologico, che è parte integrante della conferma che sia i nuclei presnaptici che …

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Questa ricerca è stata supportata dal Programma di ricerca intramurale del NIH, NIDCD, Z01 DC000091 (CJCW).

Materials

Experimental Preparations
Agar, powder Fisher Scientific BP1423500 4% agar block used to stabilize brain tissue during vibratome sectioning
AlexaFluor Hydrazide 488 Invitrogen A10436 Fluorophore used in internal solution to confirm successful MOC neuron patch
Analytical Balance Geneses Scientific (Intramalls) AV114 Weighing chemicals
Double edged razor blade Ted Pella 121-6 Vibratome cutting blade
Kynurenic acid (5g) Sigma Aldrich K3375-5G Slicing ACSF additive used to reduce neuron activity during dissection and slicing in order to improve tissue health for patch clamping
pH Meter Fisher Scientific (Intramalls) 13-620-451 Solution pH tester
Plastic petri dishes 100mm dia X 20mm Fisher Scientific (Intramalls) 12-556-002 4% Agar Prep
Stirring Hotplate Fisher Scientific (Intramalls) 11-500-150 Heating for 4% Agar preparation
Dissection and Slicing
Biocytin Sigma Aldrich B4261-250MG Chemical used for axonal tracing (conjugated to Streptavidin 488)
Dissecting Microscope Amscope SM-1BN For precision dissection during brain removal
Dumont #5 Forceps Fine Science Tools 11252-20 Fine forceps dissection tool
Economy tweezers #3 WPI 501976 Forceps dissection tool
Glass Petri Dish 150mm dia x 15mm H Fisher Scientific (Intramalls) 08-747E Dissection dish
Interface paper (203 X 254mm PCTE Membrane 10um) Thomas Scientific 1220823 Slice incubation/biocytin application
Leica VT1200S Vibratome Leica 1491200S001 Vibratome for wedge slice sectioning
Mayo scissors Roboz RS-6872 Dissection tool
Single-edged carbon steel blades Fisher Scientific (Intramalls) 12-640 Razor blade for dissection
Specimen disc, orienting Leica 14048142068 Specialized vibratome stage for reproducible tilting
Spoonula FisherSci 14-375-10 Dissection tool
Super Glue Newegg 15187 Used for glueing tissue to vibratome stage
Vannas Spring Scissors Fine Science Tools 91500-09 Dissection tool
Electrophysiology
A1R Upright Confocal Microscope Nikon Instruments Electrophysiology and imaging microscope, can be any microscope compatible with electrophysiology
Electrode Borosilicate glass w/ Filament OD 1.5mm, ID 1.1mm, 10 cm long Sutter Instrument BF150-110-10 Patch clamping pipette glass
Electrode Filler MicroFil WPI CMF20G Patch electrode pipette filler
In-line solution heater Warner Instruments (GSAdvantage) SH-27B Slice perfusion system heater
Multi-Micromanipulator Systems Sutter Intruments MPC-200 with MP285 Micromanipulators for patch clamp and stimulation electrode placement
P-1000 horizontal pipette puller for glass micropipettes Sutter instruments FG-P1000 Patch clamp pipetter puller
Patch-clamp amplifier and Software HEKA EPC-10 / Patchmaster Next Can be any amplifier/software
Recording Chamber Warner Instruments RC26G Slice "bath" during recording
Recording Chamber Harp Warner Instruments 640253 Stablizes slice during electrophysiology recording
Slice Incubation Chamber Custom Build Heated, oxygenated holding chamber for slices during recovery after slicing
Stimulus isolation unit A.M.P.I. Iso-Flex Stimulus isolation unit for electrophysiology
Syringe 60CC Fischer Scientific (Intramalls) 14-820-11 Electrophysiology perfusion fluid handling
Temperature controller Warner Instruments (GSAdvantage) TC-324C Slice perfusion system temperature controller
Tubing 1/8 OD 1/16 ID Fischer Scientific (Intramalls) 14-171-129 Electrophysiology perfusion fluid handling
Tugsten concentric bipolar microelectrode WPI TM33CCINS Stimulating electrode for electrophysiology
Histology
24 well Plate Fisher Scientific (Intramalls) 12-556006 Histology slice collection and immunostaining
Alexa Fluor 488 Streptavidin Jackson Immuno labs 016-540-084 Secondary antibody for biocytin visualization
Corning Orbital Shaker Sigma CLS6780FP Shaker for immunohistochemistry agitation
Cresyl Violet Acetate Sigma Aldrich (Intramalls) C5042-10G Cellular stain for histology
Disposable Microtome Blades Fisher Scientific 22-210-052 Sliding microtome blade
Filter-syringe Nalgene 4mm Cellulose Acetate 0.2um Fisher Scientific (Intramalls) 09-740-34A Syringe filter for filling recording pipettes with internal solution
Fluoromount-G Slide Mounting Medium Fisher Scientific OB100-01 Immunohistochemistry fluorescence mounting medium
glass slide staining dish with rack Fisher Scientific (Intramalls) 08-812 Cresyl Violet staining chamber
Microm HM450 Sliding Microtome ThermoFisher 910020 Freezing microtome for histology
Microscope Cover Glasses: Rectangles 50mm X 24mm Fisher Scientific (Intramalls) 12-543D Histochemistry slide cover glass
Permount mounting medium Fisher Scientific SP15-100 Cresyl violet section mounting medium
Superfrost Slides Fisher Scientific 22-034980 Histology slides

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Fischl, M. J., Weisz, C. J. C. In Vitro Wedge Slice Preparation for Mimicking In Vivo Neuronal Circuit Connectivity. J. Vis. Exp. (162), e61664, doi:10.3791/61664 (2020).

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