Préparation in vitro en tranches compensées pour imiter la connectivité du circuit neuronal In Vivo

L’observation de l’activité des circuits neuronaux est idéalement effectuée avec les entrées sensorielles indigènes et la rétroaction, et la connectivité intacte entre les régions du cerveau, in vivo. Cependant, l’exécution d’expériences qui donnent une résolution à cellule unique de la fonction du circuit neuronal est encore limitée par des défis techniques dans le cerveau intact. Bien que des méthodes d’électrophysiologie extracellulaire in vivo ou d’imagerie multiphoton puissent être utilisées pour étudier l’activité dans les systèmes nerveux intacts, il reste difficile d’interpréter comment différents intrants intègrent ou mesurent les intrants synaptiques sous-marins. Les enregistrements in vivo à cellules entières surmontent ces limitations, mais sont difficiles à réaliser, même dans les régions du cerveau qui sont facilement accessibles. Les défis techniques des expériences de résolution à cellules uniques sont encore amplifiés dans certaines populations de neurones qui sont situées profondément dans le cerveau, ou dans des populations spatialement diffuses qui nécessitent soit des outils génétiques pour localiser les cellules in vivo (p. ex., expression génétique de la canalrhodopsine associée à l’enregistrement optrode) soit une identification histochimique post-hoc après l’étiquetage du site d’enregistrement (p. ex. avec des marqueurs spécifiques à la neurotransmission). Étant situés de façon diffuse près de la surface ventrale du tronc cérébral, les neurones olivocochléaires médiaux (MOC) souffrent des limitations^{ci-dessus 1,}ce qui les rend extrêmement difficiles d’accès pour l’expérimentation in vivo.

Les tranches de cerveau (~100-500 μm d’épaisseur) ont longtemps été utilisées pour étudier les circuits cérébraux, y compris les circuits auditifs de tronc cérébral, en raison de la ségrégation physique des neurones connectés qui sont contenus dans la même^{tranche 2,3,4,5,6,7,8,9}. Des expériences utilisant des tranches beaucoup plus épaisses (>1 mm) ont été utilisées dans d’autres laboratoires pour comprendre comment les intrants bilatéraux s’intègrent dans les zones du complexe olivary supérieur (SOC) y compris l’olive supérieure^{médiale 10,11}. Ces tranches ont été préparées de telle sorte que les axones du nerf auditif (AN) sont restés intacts dans la tranche et ont été stimulés électriquement pour lancer la libération synaptique de neurotransmetteur dans le CN, imitant l’activité des neurones auditifs de premier ordre pendant qu’ils répondaient au bruit. Un inconvénient majeur de ces tranches épaisses est la visibilité des neurones pour les enregistrements électrophysiologiques patch-clamp (« patching »). Patching devient de plus en plus difficile que les nombreux axones dans ce domaine deviennent myélinated avec^{l’âge de 12,13,14,15}, ce qui rend le tissu optiquement dense et obscurcissant neurones, même dans une typique, mince tranche de cerveau. Notre objectif est de créer des préparations in vitro qui ressemblent plus étroitement à la connectivité du circuit des enregistrements in vivo, mais avec les capacités d’enregistrement à haut débit et haute résolution de l’électrophysiologie visuellement guidée patch-clamp en tranches de cerveau.

Notre laboratoire étudie la physiologie des neurones du système auditif efferent, y compris les neurones MOC. Ces neurones cholinergiques fournissent une rétroaction efferent à la cochlée en modulant l’activité des cellules ciliées externes (OHCs)^{16,17,18,19,20}. Des études antérieures ont montré que cette modulation joue un rôle dans le contrôle de la cochlée^{21,22,23,24,25},^{26 et}la protection contre les traumatismes^{acoustiques 27,28,29,30,31,32,33}. Chez la souris, les neurones MOC sont diffusement situés dans le noyau ventral du corps trapézoïde (VNTB) dans le tronc cérébral auditif¹. Notre groupe a utilisé la ligne de souris ChAT-IRES-Cre croisée avec la ligne de souris tdTomato reporter pour cibler les neurones MOC dans les tranches de tronc cérébral sous l’illumination épifluorescente. Nous avons montré que les neurones MOC reçoivent l’entrée inhibitrice afferent du noyau médial ipsilateral du corps trapézoïde (MNTB), qui est excité, à son tour, par les axones des cellules touffue globulaires (GBC) dans le noyau cochléaire contralatéral (CN)^{34,35,36,37,38}. En outre, les neurones MOC reçoivent probablement leur apport excitateur des cellules T-stellate dans le CN contralatéral^39,40,41. Pris ensemble, ces études montrent que les neurones MOC reçoivent à la fois des intrants excitatifs et inhibiteurs dérivés de la même oreille (contralatérale). Cependant, les neurones présynaptiques, et leurs axones convergeant vers les neurones MOC, ne sont pas assez proches les uns des autres pour être entièrement intacts dans une préparation typique de tranche coronale. Pour étudier comment l’intégration des intrants synaptiques aux neurones MOC affecte leurs modèles de tir potentiels d’action, en nous concentrant sur l’inhibition nouvellement décrite, nous avons développé une préparation dans laquelle nous pourrions stimuler les divers afferents aux neurones MOC d’une oreille de la manière la plus physiologiquement réaliste possible, mais avec les avantages techniques des expériences in vitro de tranches cérébrales.

La tranche compensée est une tranche épaisse modifiée conçue pour l’étude de l’intégration des circuits dans les neurones MOC (schématisé dans la figure 1A). Sur le côté épais de la tranche, le coin contient les axones sectionnés du nerf auditif (appelé « racine de nerf auditif » ci-après) lorsqu’ils pénètrent dans le tronc cérébral à partir de la périphérie et de la synapse du CN. La racine auditive de nerf peut être électriquement stimulée pour évoquer la libération de neurotransmetteur et l’activation synaptique des cellules du CN entièrement intact^{42,43,44,45,46.} Ce format de stimulation a plusieurs avantages pour l’analyse de circuit. Tout d’abord, au lieu de stimuler directement les axones T-stellate et GBC qui fournissent une entrée afferent aux neurones MOC, nous stimulons l’AN pour permettre l’activation des circuits intrinsèques abondants dans le CN. Ces circuits modulent la production de neurones CN à leurs cibles dans tout le cerveau, y compris les neurones MOC^{46,47,48,49,50,51}. Deuxièmement, l’activation polysynaptique des circuits afferents de l’AN à travers le CN en amont des neurones MOC permet un timing d’activation plus naturel et pour la plasticité de se produire à ces synapses comme ils le feraient in vivo pendant la stimulation auditive. Troisièmement, nous pouvons varier nos modèles de stimulation pour imiter une activité. Enfin, les projections monaurales excitatrices et inhibitrices des neurones MOC sont intactes dans la tranche compensée, et leur intégration peut être mesurée à un neurone MOC avec la précision de l’électrophysiologie patch-clamp. Dans l’ensemble, ce système d’activation fournit un circuit plus intact aux neurones MOC par rapport à une préparation typique des tranches de cerveau. Cette tranche de coin de tronc cérébral peut également être employée pour étudier d’autres secteurs auditifs qui reçoivent l’entrée inhibitrice du MNTB ipsilateral comprenant l’olive supérieure latérale, le noyau olivary supérieur et l’olive supérieure médiale^{10,11,52,53,54,55,56.} Au-delà de notre préparation spécifique, cette méthode de tranchage peut être utilisée ou modifiée pour évaluer d’autres systèmes avec les avantages de maintenir la connectivité des entrées à longue portée et d’améliorer la visualisation des neurones pour une variété d’électrophysiologie à résolution unicellique ou de techniques d’imagerie.

Ce protocole nécessite l’utilisation d’un stade ou d’une plate-forme vibratoire qui peut être incliné d’environ 15°. Ici, nous utilisons une scène magnétique de 2 pièces disponible dans le commerce où la « scène » est un disque métallique avec un fond incurvé placé dans une concave magnétique « base de scène. » La scène peut ensuite être déplacée pour ajuster l’angle de la tranche. Des cercles concentriques sur la base de scène sont utilisés pour estimer l’angle reproductiblement. La scène et la base de la scène sont placées dans la chambre de tranchage, où la base de scène magnétique peut également être tournée.