Descrevemos um protocolo simples para desenvolver organoides epiteliais mucociliais a partir de células ectoderm profundas isoladas dos embriões Xenopus laevis. Os progenitores multipotentes regeneram precursores de células de cálice epitelial e permitem o acompanhamento ao vivo da iniciação e progressão das transições celulares na superfície dos organoides.
O epitélio mucociliary fornece a primeira linha de defesa removendo partículas estranhas através da ação da produção de muco e liberação mediada por cílios. Muitos defeitos clinicamente relevantes no epitélio mucociliary são inferidos à medida que ocorrem profundamente dentro do corpo. Aqui, introduzimos um modelo 3D tratável para epitélio mucociliário gerado a partir de progenitores multipotentes que foram microsurgicamente isolados dos embriões Xenopus laevis. Os organoides epiteliais mucociliais são cobertos com epitélio recém-gerado a partir de células ectoderme profundas e posteriormente decorados com distintas células multiciliadas padronizadas, células secretas e células de cálice produtoras de muco que são indistinguíveis da epiderme nativa dentro de 24 horas. As sequências completas de transições celulares dinâmicas de mesenquimal para epitelial que emergem na superfície apical dos organoides podem ser rastreadas por imagens ao vivo de alta resolução. Esses organoides epiteliais mucociliais in vitro, auto-organizados, oferecem vantagens distintas no estudo da biologia do epitélio mucocilial com alta eficiência na geração, condições de cultura definidas, controle sobre número e tamanho e acesso direto à imagem ao vivo durante a regeneração do epitélio diferenciado.
Lesões, infecções e doenças do epitélio mucociliário estão associadas à produção prejudicada e ao despejo de muco, que muitas vezes é encontrado em doenças pulmonares pulmonares crônicas, asma, fibrose cística, bronquiectase e diskinesia ciliar primária1,2,3,4. Um recente avanço na tecnologia organoide, por exemplo, o organoide pulmonar derivado de células basais chamado traqueosfera que recapitula a regeneração do epitélio mucociliary surge como um modelo promissor com potencial terapêutico1,5,6. No entanto, seu uso é atualmente limitado, em parte devido à falta das condições de cultura definidas e à baixa eficiência nas produções organoides. Epitélio mucociliary nas vias aéreas humanas e epiderme de sapo são notavelmente semelhantes em morfologia tecidual, composição celular, e sua função7,8,9,10,11,12. Em ambos os organismos, o epitélio mucociliary fornece defesa de primeira linha, secretando substâncias mucosas e antimicrobianas e limpa partículas e patógenos nocivos através da ação sincronizada de cílios.
Aqui, descrevemos um protocolo simples para gerar organoides epiteliais mucociliais usando os progenitores multipotentes dos embriões Xenopus laevis 13,14. Anteriormente, relatamos14 que, na ausência de fatores de crescimento exógenos e da matriz extracelular, as células profundas microsurgicamente isoladas do estágio gastrula precoce se reúnem espontaneamente em agregados, regeneram o epitélio em sua superfície e amadurecem em epitélio mucociliário, intercalando células multicilitárias e outras células acessórios dentro de 24h. Além do rápido desenvolvimento, este protocolo oferece uma oportunidade distinta para acessar diretamente as transições de células ectoderme profunda multipotentes em progenitores de células de cálice epitelial que recapitulam as etapas de regeneração de um epitélio14 interrompido que não estão disponíveis a partir de embriões intactos e ectoderme (também conhecido como cape animal)15,16,17. O número e o tamanho dos organoides produzidos são escaláveis com alta eficiência, controlando os materiais iniciais dos embriões Xenopus. Organoides na cultura flutuante podem ser facilmente classificados e transferidos na fase desejada para análises posteriores, incluindo imagens de alta resolução, testes mecânicos, tratamento medicamentoso e caracterização genética14. Esta regeneração espontânea e baseada em mecânica tecidual do epitélio na superfície dos agregados de células embrionárias resulta em organoides epiteliais mucociliais e fornecem um novo modelo tridimensional (3D) para estudar a biologia do epitélio mucociliário.
Organoides epiteliais mucociliais gerados a partir de células de ectoderme profundos do embrião X. laevis são uma ferramenta poderosa para estudar a epitelialização e diferenciação de progenitores multipotentes in vitro. Em contraste com o ensaio da tampa animal amplamente adotado16 utilizado para organogênese in vitro13 e o desenvolvimento da epitélio mucociliaria15,17,22 que utilizam o ectoderme intacto, os organoides derivados do ectoderme profundo apresentados neste protocolo oferecem uma oportunidade distinta de monitorar as fases de regeneração orientadas pela mecânica tecidual do epitélio superficial14. Em torno de 2 hpa, as células epiteliais positivas zo-1 recém-geradas(Figura 2) começam a aparecer na superfície apical dos organoides e aumentam sua população para cobrir todo o organoide à medida que o tecido solidifica ou reduz a conformidade14. A regeneração do epitélio e as especificações subsequentes de linhagem para células de cálice produtoras de muco prosseguem espontaneamente em uma mídia cultural quimicamente definida dentro de um dia. Estes organoides epiteliais mucociliais em rápido desenvolvimento fornecem uma plataforma para examinar comportamentos celulares dinâmicos em tempo real, em alta resolução, durante etapas progressivas de regeneração epitelial. Também permitem a investigação de questões fundamentais que surgem durante o desenvolvimento do epitélio mucociliary, homeostase e doenças associadas2,9,23. Em particular, a sensibilidade mecânica das células progenitoras profundas durante a transição para precursores de células de cálice epitelial identificadas nos organoides14 pode servir para ligar doenças respiratórias associadas à diferenciação basal anormal onde as células de cálice que se secretam muco estão sobre ou sub-produzidas23.
Embora este protocolo ofereça uma abordagem simples para gerar esses organoides, existem várias etapas críticas para o sucesso em experimentos. Para evitar a contaminação de células epiteliais superficiais durante o isolamento de células de ectoderme profundo da tampa animal, deve-se monitorar a tampa animal colocada em DFA livre de cálcio e magnésio sob um estereoscópio e detectar o momento certo para iniciar a separação da camada superficial pigmentada escura da tampa animal. Se o tecido for mantido em DFA livre de cálcio e magnésio por muito tempo, todo o tecido se dissociará e distinguir entre células profundas e superficiais seria então impossível para agregados profundos de ectoderme. Para confirmar a ausência de células superficiais em agregados de ectoderme profundo, recomendamos rotular fluorescentemente a superfície apical do embrião com NHS-rhodamina (passo 1.414) antes da microcirurgia; isso permitiria fácil identificação de células superficiais se existissem nos organoides resultantes. Uma vez que a regeneração epitelial é regulada pela mecânica tecidual14, é essencial evitar a geração de força não intencional para organoides auto-organizados. Em particular, sugerimos evitar o contato com o fundo de vidro da câmara de imagem durante a imagem ao vivo, colocando agregados nas bordas das grades TEM, pois isso permite o contato livre com a janela de imagem dos agregados ao vivo (passo 5.1.2.). Este modelo 3D in vitro–cultivado e auto-organizado para epitélio mucociliário servirá como uma ferramenta tratável para responder às questões fundamentais que surgem durante a regeneração do epitélio e a especificação de linhagem das células de cálice.
The authors have nothing to disclose.
Agradecemos aos membros do laboratório Kim e Lance Davidson por seus comentários e apoio. Este trabalho foi apoiado pela Young Scientist Fellowship para hyk do Institute for Basic Science (IBS-R0250Y1).
Equipment | |||
Dual-stage Glass Micropipette Puller | Narishige | PC-100 | |
Picoliter microinjector | Warner Instruments | PLI-100A | |
Confocal Laser Microscope | |||
Stereoscope | |||
Tools | |||
Forcep | Dumont | Dumont #5 | |
Hair knife | Reference (Kay, B.K.; Peng, H.B., 1991) | ||
Hair loop | Reference (Kay, B.K.; Peng, H.B., 1991) | ||
hCG injection | |||
human chorionic gonadotropin | Sigma | cg10-10vl | |
MBS solution | |||
10M Sodium hydroxide | Sigma | 72068 | |
Calcium chloride | Sigma | C3881 | |
Calcium nitrate | Sigma | C1396 | |
HEPES | Sigma | H4034 | |
Magnesium sulfate | Sigma | 230391 | |
Phenol-red | Sigma | P0290 | |
Potassium chloride | Sigma | 7447-40-7 | |
Sodium bicarbonate | Sigma | S6014 | |
Sodium chloride | Sigma | S9625 | |
Sodium hydroxide reagent grade, 97%, powder-25g | Sigma | 655104 | |
dejellying solution | |||
L-Cysteine hydrochloride monohydrate | Sigma | C7880 | |
Sodium hydroxide 10M | Sigma | 72068 | |
Ficoll solution | |||
Ficoll | Sigma | F4375 | |
DFA solution | |||
Sodium chloride | Sigma | S9625 | |
0.22mm Filter | Millipore | S2GPT05RE | |
Antibiotic Antimycotic Solution | Sigma | A5955 | |
Bicine | Sigma | B3876 | |
Calcium chloride | Sigma | C3881 | |
Magnesium sulfate | Sigma | 230391 | |
Potassium gluconate | Sigma | G4500 | |
Sodium carbonate | Sigma | 222321 | |
Sodium gluconate | Sigma | G9005 | |
mRNA in vitro transcription | |||
SP6/T7 in vitro transcription kit | Invitrogen | AM1340 | |
mRNA microinjection | |||
Borosilicate glass capillary tubes | Harvard Apparatus | GC100-10 | |
Eppendorf microloader pipette tips | ThermoFisher | A25547 | |
Mineral oil | Sigma | M5904 | |
PCR tube coating | |||
BSA | Thermofisher | 26140079 | |
PCR tubes | SSI | SSI-3245-00 | |
Imaging | |||
Custom-milled acrylic chamber | |||
Coverglass 24mmX50mm | Duran | B01_001650 | |
SPI Hexagonal TEM Grids, Gilded Nickel (50mesh) | SPI | 275HGN-XA | |
SPI Hexagonal TEM Grids, Gilded Nickel (75mesh) | SPI | 2775GN-XA | |
Silicone grease | Shinetsu | HIVAC-G | |
Fixation | |||
20ml screw top-cap vial | Wheaton | WH.986580 | |
2ml screw top-cap vial | |||
Benzyl alcohol | Sigma | 305197 | |
Benzyl benzoate | Sigma | B6630 | |
Dimethyl sulfoxide (DMSO) | Sgima | D4540 | |
Glutaraldehyde 10% EM GRADE | Electron Microscopy Sciences | 16120 | |
Goat serum | Jackson | 005-000-121 | |
Methanol | Sigma | 322415 | |
Paraforlamdehyde | Sigma | P6148 | |
Phosphate-buffered saline (PBS) | LPS Solution | CBP007B | |
Triton X-100 | Sigma | T8787 | |
Primary antibody (1:200) | |||
acetylated tubulin | Sigma | clone 6-11B-1 | |
Itln1 | Proteintech | 11770-1-AP | |
Keratin | Developmental Studies Hybridoma Bank | 1h5 | |
ZO1 | Invitrogen | 402200 | |
Vectors | |||
pCS2-mem-GFP | Gift from Dr. Lance Davidson | ||
pCS2-ZO1-RFP | Gift from Dr. Lance Davidson |