Nous décrivons un protocole simple pour développer des organoïdes épithéliales mucociliary des cellules profondes d’ectoderm isolées des embryons de Xenopus laevis. Les progéniteurs multipotents régénèrent les précurseurs épithéliales des cellules gobelet et permettent un suivi en direct de l’initiation et de la progression des transitions cellulaires à la surface des organoïdes.
L’épithélium mucociliaire fournit la première ligne de défense en enlevant les particules étrangères par l’action de la production de mucus et du dégagement cils- médiatisé. Beaucoup de défauts médicalement pertinents dans l’épithélium mucociliary sont déduits car ils se produisent profondément dans le corps. Ici, nous introduisons un modèle 3D tractable pour l’épithélium mucociliary produit à partir d’ancêtres multipotents qui ont été microchirurgically isolés des embryons de Xenopus laevis. Les organoïdes épithéliales mucociliaires sont recouverts d’épithélium nouvellement généré à partir de cellules ectoderm profondes et décorés plus tard de cellules multiciliées à motifs distincts, de cellules sécrétrices et de cellules gobelet productrices de mucus qui sont indiscernables de l’épiderme indigène dans les 24 h. Les séquences complètes des transitions cellulaires dynamiques de la mésenchymie à l’épithéliale qui émergent sur la surface apical des organoïdes peuvent être suivies par imagerie vivante à haute résolution. Ces organoïdes épithéliales mucociliaires cultivés in vitro offrent des avantages distincts dans l’étude de la biologie de l’épithélium mucociliaire avec une efficacité élevée dans la génération, des conditions de culture définies, le contrôle du nombre et de la taille, et un accès direct à l’imagerie vivante pendant la régénération de l’épithélium différencié.
Les dommages, l’infection, et la maladie de l’épithélium mucociliary sont associés à la production et au dégagement altérés du mucus qui se trouve souvent dans les désordres pulmonaires tels que la maladie pulmonaire obstructive chronique, l’asthme, la fibrose kystique, la bronchiectasie, et la dyskinésie ciliaireprimaire 1,2,3,4. Une avancée récente dans la technologie organoïde, par exemple, l’organoïde pulmonaire dérivé de cellules basales appelé trachéosphère qui récapitule la régénération de l’épithélium mucociliaire apparaissent comme un modèle prometteur avec un potentielthérapeutique 1,5,6. Cependant, son utilisation est actuellement limitée, en partie en raison de l’absence des conditions de culture définies et de la faible efficacité dans les productions organoïdes. L’épithélium mucociliaire dans les voies respiratoires humaines et l’épiderme de grenouille sont remarquablement semblables dans la morphologie de tissu, la composition cellulaire,et sa fonction 7,8,9,10,11,12. Dans les deux organismes, l’épithélium mucociliaire assure la défense de première ligne en sécrétant des substances mucus et antimicrobiennes et dégage des particules nocives et des agents pathogènes par l’action synchronisée des cils.
Ici, nous décrivons un protocole simple pour générer des organoïdes épithéliales mucociliaires utilisant les progéniteurs multipotents des embryons de Xenopus laevis 13,14. Précédemment, nous avonsrapporté 14 qu’en l’absence des facteurs exogènes de croissance et de la matrice extracellulaire, les cellules profondes microchirurgically isolées de l’ectoderm tôt de stade de gastrula s’assemblent spontanément en agrégats, régénèrent l’épithélium à sa surface, et mûrissent dans l’épithélium mucociliary en intercalant les cellules multiciliated et d’autres accessoires dans un délai de 24 h. En plus du développement rapide, ce protocole offre une occasion distincte d’accéder directement aux transitions des cellules ectoderm profondes multipotentes en progéniteurs épithéliales de cellules gobelet qui récapitulent les étapes de régénération d’un épithélium14 perturbé qui ne sont pas disponibles à partir d’embryons intacts et d’ectoderm (également connu sous le nom de capuchon animal)15,16,17. Le nombre et la taille des organoïdes produits sont évolutifs avec une grande efficacité en contrôlant les matériaux de départ des embryons Xenopus. Les organoïdes en culture flottante peuvent être facilement triés et transférés au stade désiré pour d’autres analyses, y compris l’imagerie à haute résolution, les essais mécaniques, le traitement médicamenteux et la caractérisationgénétique 14. Cette régénération spontanée et axée sur la mécanique tissulaire de l’épithélium à la surface des agrégats cellulaires embryonnaires entraîne des organoïdes épithéliales mucociliaires et fournit un nouveau modèle tridimensionnel (3D) pour étudier la biologie de l’épithélium mucociliaire.
Les organoïdes épithéliales mucociliaires générés à partir de cellules ectoderm profondes de l’embryon X. laevis sont un outil puissant pour étudier l’épithélialisation et la différenciation des progéniteurs multipotents in vitro. Contrairement à l’essai de capuchon animal largement adopté16 utilisé pour l’organogenèse in vitro13 et le développement de l’épithélie mucociliaire15,17,22 qui utilisent l’ectoderm intact, les organoïdes dérivés de l’ectoderm profond présentés dans ce protocole offrent une occasion distincte de surveiller les phases de régénération mécanique tissulaire de l’épithélium de surface14. À environ 2 hpa, les cellules épithéliales positives ZO-1 nouvellement générées (figure 2) commencent à apparaître sur la surface apical des organoïdes et augmentent leur population pour couvrir l’organoïde entier pendant que le tissu solidifie ou réduit la conformité14. La régénération de l’épithélium et les spécifications de lignée subséquentes pour les cellules de gobelet productrices de mucus procèdent spontanément dans un média de culture chimiquement défini en un jour. Ces organoïdes épithéliales mucocristalaires qui se développent rapidement fournissent une plate-forme pour examiner les comportements cellulaires dynamiques en temps réel, en haute résolution, lors des étapes progressives de la régénération épithéliale. Ils permettent également d’investigation des questions fondamentales qui se posent pendant le développement mucociliary d’épithélium, l’homéostasie, et les maladiesassociées 2,9,23. En particulier, la sensibilité mécanique des cellules progénitrices profondes pendant la transition vers les précurseurs épithéliales de cellules de gobelet identifiés dans les organoïdes14 peut servir à relier les maladies respiratoires associées à la différenciation basale anormale où les cellules de gobelet sécrétant le mucus sont surproduiteou sous-produites 23.
Bien que ce protocole offre une approche simple pour générer ces organoïdes, il ya plusieurs étapes critiques pour le succès dans les expériences. Pour éviter la contamination des cellules épithéliales superficielles pendant l’isolement des cellules profondes d’ectoderm de la calotte animale, il faut surveiller le capuchon animal placé dans le DFA sans calcium et magnésium sous un stéréoscope et détecter le bon moment pour initier la séparation de la couche superficielle pigmentée foncée de la calotte animale. Si le tissu est maintenu dans le DFA sans calcium et magnésium pendant trop longtemps, le tissu entier se dissociera et la distinction entre les cellules profondes et superficielles serait alors impossible pour les agrégats profonds d’ectoderm. Pour confirmer l’absence de cellules superficielles dans les agrégats profonds d’ectoderm, nous recommandons d’étiqueter fluorescentement la surface apical de l’embryon avec nhs-rhodamine (étape1.4 14) avant la microchirurgie ; cela permettrait une identification facile des cellules de surface si elles existent dans les organoïdes qui en résultent. Puisque la régénération épithéliale est réglée par la mécaniquetissulaire 14,il est essentiel d’éviter la génération involontaire de force pour les organoïdes auto-organisateurs. En particulier, nous suggérons d’éviter tout contact avec le fond de verre de la chambre d’imagerie pendant l’imagerie en direct en plaçant des agrégats sur les bords des grilles TEM, car cela permet un contact libre avec la fenêtre d’imagerie des agrégats vivants (étape 5.1.2.). Ce modèle 3D in vitro–cultivé et auto-organisé pour l’épithélium mucociliaire servira d’outil tractable pour répondre aux questions fondamentales qui se posent lors de la régénération de l’épithélium et de la spécification de lignée des cellules gobelet.
The authors have nothing to disclose.
Nous remercions les membres de Kim Lab et Lance Davidson pour leurs commentaires et leur soutien. Ces travaux ont été soutenus par la Bourse des jeunes scientifiques à HYK de l’Institute for Basic Science (IBS-R0250Y1).
Equipment | |||
Dual-stage Glass Micropipette Puller | Narishige | PC-100 | |
Picoliter microinjector | Warner Instruments | PLI-100A | |
Confocal Laser Microscope | |||
Stereoscope | |||
Tools | |||
Forcep | Dumont | Dumont #5 | |
Hair knife | Reference (Kay, B.K.; Peng, H.B., 1991) | ||
Hair loop | Reference (Kay, B.K.; Peng, H.B., 1991) | ||
hCG injection | |||
human chorionic gonadotropin | Sigma | cg10-10vl | |
MBS solution | |||
10M Sodium hydroxide | Sigma | 72068 | |
Calcium chloride | Sigma | C3881 | |
Calcium nitrate | Sigma | C1396 | |
HEPES | Sigma | H4034 | |
Magnesium sulfate | Sigma | 230391 | |
Phenol-red | Sigma | P0290 | |
Potassium chloride | Sigma | 7447-40-7 | |
Sodium bicarbonate | Sigma | S6014 | |
Sodium chloride | Sigma | S9625 | |
Sodium hydroxide reagent grade, 97%, powder-25g | Sigma | 655104 | |
dejellying solution | |||
L-Cysteine hydrochloride monohydrate | Sigma | C7880 | |
Sodium hydroxide 10M | Sigma | 72068 | |
Ficoll solution | |||
Ficoll | Sigma | F4375 | |
DFA solution | |||
Sodium chloride | Sigma | S9625 | |
0.22mm Filter | Millipore | S2GPT05RE | |
Antibiotic Antimycotic Solution | Sigma | A5955 | |
Bicine | Sigma | B3876 | |
Calcium chloride | Sigma | C3881 | |
Magnesium sulfate | Sigma | 230391 | |
Potassium gluconate | Sigma | G4500 | |
Sodium carbonate | Sigma | 222321 | |
Sodium gluconate | Sigma | G9005 | |
mRNA in vitro transcription | |||
SP6/T7 in vitro transcription kit | Invitrogen | AM1340 | |
mRNA microinjection | |||
Borosilicate glass capillary tubes | Harvard Apparatus | GC100-10 | |
Eppendorf microloader pipette tips | ThermoFisher | A25547 | |
Mineral oil | Sigma | M5904 | |
PCR tube coating | |||
BSA | Thermofisher | 26140079 | |
PCR tubes | SSI | SSI-3245-00 | |
Imaging | |||
Custom-milled acrylic chamber | |||
Coverglass 24mmX50mm | Duran | B01_001650 | |
SPI Hexagonal TEM Grids, Gilded Nickel (50mesh) | SPI | 275HGN-XA | |
SPI Hexagonal TEM Grids, Gilded Nickel (75mesh) | SPI | 2775GN-XA | |
Silicone grease | Shinetsu | HIVAC-G | |
Fixation | |||
20ml screw top-cap vial | Wheaton | WH.986580 | |
2ml screw top-cap vial | |||
Benzyl alcohol | Sigma | 305197 | |
Benzyl benzoate | Sigma | B6630 | |
Dimethyl sulfoxide (DMSO) | Sgima | D4540 | |
Glutaraldehyde 10% EM GRADE | Electron Microscopy Sciences | 16120 | |
Goat serum | Jackson | 005-000-121 | |
Methanol | Sigma | 322415 | |
Paraforlamdehyde | Sigma | P6148 | |
Phosphate-buffered saline (PBS) | LPS Solution | CBP007B | |
Triton X-100 | Sigma | T8787 | |
Primary antibody (1:200) | |||
acetylated tubulin | Sigma | clone 6-11B-1 | |
Itln1 | Proteintech | 11770-1-AP | |
Keratin | Developmental Studies Hybridoma Bank | 1h5 | |
ZO1 | Invitrogen | 402200 | |
Vectors | |||
pCS2-mem-GFP | Gift from Dr. Lance Davidson | ||
pCS2-ZO1-RFP | Gift from Dr. Lance Davidson |