Мукоцилиальные эпителиальные органоиды из эмбриональных клеток Ксенопы: Поколение, Культура и живая визуализация высокого разрешения

Протоколы использования животных и экспериментальные протоколы были утверждены институциональным комитетом по уходу за животными (IACUC) Института фундаментальных наук (IBS 18-01) и Корейским передовым институтом науки и техники (KA2017-22). 1. Эмбрионы Получить X. laevis эмбрионов с помощью стандартной процедуры: вручную собирать яйца из стимулированных самок лягушек и выполнять экстракорпоральноеоплодотворение 18,19. Де-желе оплодотворенных эмбрионов с нежным возбуждением около 5 мин в 2% цистеина в 1/3x модифицированный солевой Барта (MBS; см. рецепт 1X MBS ниже) при рН 819. Дополнительный шаг для живой визуализации: флуоресцентно маркировать специфические белки и наблюдать их динамику в органоиде, переходить к разделу 5. (По желанию) Для мониторинга загрязнения поверхностных эктодермальных клеток в органоидах, этикетка апической поверхности эмбрионов с NHS-родамин на стадии 914. Инкубация эмбрионов в 1 мг/мл NHS-родамина в 1/3x MBS (рН 9,0) в течение 30 мин с нежным гайкой. Вымойте эмбрионы три раза, переведя в чашку Петри заполненную 1/3x MBS в течение 15 минут. Культура эмбриона в 1/3x MBS при предпочтительной температуре (14-26 градусов по Цельсию) до тех пор, пока не будут обнаружены первые признаки 10-й стадии (т.е. появление темных пигментированных клеток вокруг блатопора на вегетативном представлении). 2. Подготовка микрохирургических инструментов, решений и культурных сосудов Подготовь инструменты, необходимые в том числе пару хирургических стиппов класса и волос инструменты (петля волос и нож для волос) длямикрохирургии 20. Подготовка следующих средств культуры для эмбрионов: 1/3X MBS, где 1X MBS сделан с NaCl (88 mM), KCl (1 mM), NaHCO3 (2.4 mM), MgSO4 (0.82 mM), Ca(No3)2 (0.33 mM), CaCl2 (0.41 mM), и HEPES (10 mM). Отрегулируйте рН до 7,4 с 10 M NaOH.ПРИМЕЧАНИЕ: Дополнительно: добавить капли фенола красный, чтобы указать рН. Подготовь следующие средства культуры для эмбриональных тканей и органоидов: Данильчик для Эми (DFA)21 дополнен свежим 1% антибиотиком и антимикотическим раствором. Подготовка DFA с NaCl (53 мМ), Na2CO3 (5 мМ), глюконат калия (4,5 мМ), глюконат натрия (32 мМ), CaCl2 (1 мМ) и MgSO4 (1 мМ). Отрегулируйте рН до 8,3 с гранулированным бицином. Фильтр DFA (фильтр с бутылкой 0,2 мкм), aliquot и хранить его при -20 градусов по Цельсию. Подготовка кальция и магния, свободной DFA для отделения глубоких клеток от эктодерма с помощью рецепта выше и опуская CaCl2 и MgSO4. Aliquot и хранить при -20 градусов по Цельсию. Подготовка неклейвых ПЦР труб для агрегации эмбриональных клеток. Чтобы вызвать спонтанную агрегацию изолированных эмбриональных клеток, подготовьте неклейвые ПЦР трубки, покрывая трубы ПЦР круглым дном при температуре 200 МКЛ 1% BSA (1 г BSA в 100 мл дистиллированной воды) на ночь при температуре 4 градусов по Цельсию или 2 ч при комнатной температуре. Каждая трубка будет использоваться для сборки одного органоида. Промыть BSA покрытием ПЦР трубки с DFA три раза, чтобы удалить любые остаточные BSA. Заполните ПЦР трубки с 200 йл DFA. 3. Изоляция глубоких эктодермальных клеток Выберите и соберите эмбрионы по мере их достижения на ранней стадии 10 с помощью инструментов для волос под стереоскопом. Используя одноразовый переносной пипетки, перенесите отобранные эмбрионы в заполненную DFA чашку Петри. Удалите вителлиновую мембрану эмбрионов с помощью острых типсов с вегетативной стороны, не нарушая сторону эмбриона.ПРИМЕЧАНИЕ: Будьте осторожны, чтобы избежать разоблачения эмбрионов в воздухе. Введение пузырьков воздуха в раствор или вывод эмбрионов на поверхность приведет к взрыву эмбриона. Чтобы изолировать крышку животного, распоить животную сторону эмбриона вверх. Визуально оцените размер крышки животного, которая будет вырезана, и сделайте первый разрез вдоль края крышки животного с помощью ножа для волос. Вытяните нож для волос наружу, чтобы сделать разрез. Повторите шаг 3.5, чтобы создать цепочку небольших порезов, чтобы акцизную крышку животного. Обрезать толстый слой края крышки животного с помощью ножа для волос, чтобы предотвратить включение мезодерм прекурсоров.ПРИМЕЧАНИЕ: Чтобы предотвратить заживление и агрегацию изолированных животных шапки, перейти к следующему шагу в течение 10 минут. Как правило, мы изолируют 5-10 шапки животных в то время, чтобы собрать несколько органоидов. Чтобы отделить глубокие эктодермальные клетки от крышки животного, перенесите вырезанные колпачки животных в чашку Петри, наполненную без кальция и магния DFA с одноразовой трубкой передачи. Будьте осторожны, чтобы не ввести пузырьки воздуха во время передачи. Чтобы сохранить достаточно места для следующих шагов, используя инструменты для волос, положение животных шапки лицом к животному стороне вверх и поддерживать щедрое расстояние от других explants. Подождите 5-10 минут, а затем контролировать explants под стереоскопом. После того, как ослабленные глубокие клетки были найдены от края темного пигментного поверхностного слоя, начать поднимать поверхностный слой от светлых глубоких клеток эктодерма с помощью волосяного ножа под стереоскопом. Аккуратно отсоедините (отсоедините) поверхностный слой ножом для волос, начиная с края. Соберите глубокие эктодермальные клетки с минимальным устремлением (10-u201215 L), чтобы ограничить количество без кальция и магния DFA, которое передается в агрегации средств массовой информации на следующем этапе.ПРИМЕЧАНИЕ: Отдельные поверхностные клетки могут быть удалены из средств массовой информации, чтобы предотвратить загрязнение оставшихся глубоких клеток эктодерма. 4. Поколение мукоцилиальных эпителиальных органоидов Передача собранных глубоких эктодермальных клеток в неклейвую ПЦР-трубку, содержащую 200 МКЛ DFA. Аккуратно пипетка средств массовой информации (2’u20123 раз) для разгона переданных ячеек в трубке ПЦР.ПРИМЕЧАНИЕ: Сроки, обозначенные как часы после агрегирования (hpa) начинается с этого шага. Размер полученных органоидов контролируется количеством глубоких эктодермальных клеток, добавленных в ПЦР-трубку. Глубокие эктодермальные клетки из одного или более колпачков животных могут быть использованы, в зависимости от желаемого размера органоида. Закройте трубку ПЦР. Держите ПЦР трубки вертикально, чтобы вызвать спонтанную агрегацию в нижней части. Мониторинг процесса агрегации под стереоскопом. Клетки обычно собираются в нижней части трубки ПЦР в течение часа и собираются в сферические агрегаты в пределах 2-3 ч, в зависимости от размера. Для проведения живой визуализации или тестирования на наркотики во время разработки мукокоцилиальных эпителиальных органоидов, собирать агрегаты на 2 л.с. с помощью трубы 200 л, оснащенной увеличенными наконечниками (нарезать стерилизованными ножницами), чтобы избежать повреждения агрегатов во время сбора. Чтобы агрегаты развивались в слизистую эпителиальный органоид в культуре, собирайте сферические агрегаты из трубки ПЦР при 5 л.с. и перенесите их в заполненную DFA чашку Петри. Распоить агрегаты далеко от других, чтобы предотвратить их слияние. В пределах 24 ч культуры при комнатной температуре без каких-либо дополнительных факторов, зрелые слизистые эпителиальные органоиды могут наблюдаться, чтобы вращаться с действием избиения ресничок, покрывающих поверхность дифференцированного эпителия 5. (Необязательно) высокое разрешение живой визуализации развивающихся органоидов Подготовка мРНК для микроинъекции. Чтобы визуализировать эпителиализацию, которая происходит на начальной стадии органоидного образования, подготовить мРНК для эпителиальной специфической зонулы occludens белка-1 (ЗО-1) и для излагания клеточных мембран путем усиления pCS2-ЗО1-RFP и pCS2-mem-GFP плазмидов (подарок от Лэнса Дэвидсона). Извлекайте и вышифровывайте плазмидную ДНК, а затем транскрибируйте ограниченную мРНК с помощью комплекта транскрипции SP6/T7 in vitro. Aliquot транскрибируется мРНК и хранить его при -80 градусов по Цельсию. Микроинъекционная мРНК в оплодотворенный эмбрион Поместите оплодотворенные эмбрионы в 3% Ficoll в 1x MBS. Загрузите 3-4 МКЛ мРНК с помощью наконечника микрозагрузщика в вытянутую стеклянную иглу (длинный и тонкий конические кончики иглы с внутренним диаметром 10-201230 мкм). Прикрепите иглу к микроинъектору и отрегулируйте время и давление, чтобы обеспечить постоянный объем мРНК для микроинъекции. Ввимите мРНК прямо под апическую поверхность полюса животного. Различные бледно-цветные круговые патч, который вызван расширением коры видна во время микроинъекции. Перенесите вводимые эмбрионы на 1/3X MBS и свяжете их до стадии 9.5. Соберите флуоресцентно помеченные эмбрионы под стереоскопом флуоресценции (настройки возбуждения/выброса для GFP (488/510) и RFP (532/588)). Продолжить шаг 1.3. Соберите и культуру органоидов (разделы 3 и 4) до желаемой стадии развития. Выполните живую визуализацию. Подготовьте камеру визуализации со стеклянным дном, приклеив крышку стекла к специально измельченной акриловой камере с использованием кремниевой смазки.ПРИМЕЧАНИЕ: Плотно запечатать камеру, чтобы предотвратить утечку культурных средств массовой информации. Заполните камеру визуализации DFA. Выберите одну шестиугольную электронную микроскопию передачи (TEM) сетки (75 сетки) из контейнера с помощью типсов и применить небольшое количество жира к краю сетки.ПРИМЕЧАНИЕ: Размер сетки должен быть меньше диаметра агрегата, так что агрегат находится на сетке. Нажмите вниз слегка, чтобы обеспечить сетку TEM в нижней части камеры изображения. Перенесите агрегаты в камеру визуализации и распоите их в сетке.ПРИМЕЧАНИЕ: Избегайте позиционирования агрегатов рядом с смазкой. На протяжении всего эксперимента агрегаты должны сидеть на сетке TEM, не контактируя с нижней частью камеры, чтобы предотвратить физическое сжатие. Заполните камеру изображения с DFA и запечатать его с крышкой стекла и жира.ПРИМЕЧАНИЕ: Камера должна быть герметичной без пузырьков воздуха, чтобы предотвратить турбулентность или движение во время изображения. Чтобы следить за прогрессированием слизистой оболочки эпителиального органоидного образования, соберите замедленное z-стек изображения агрегатов (от 2 л.с.) с помощью конфокального микроскопа.ПРИМЕЧАНИЕ: Мы обычно собираем z-стеки толщиной 120 мкм каждые 15 минут, используя цель 20X, чтобы следить за динамическим поведением клеток, но эти спецификации должны быть оптимизированы для целей экспериментов. 6. (Необязательно) Изображение развивающихся органоидов путем фиксации и иммуностимулирования Исправить органоиды на желаемой стадии развития, передав их в стеклянный флакон, наполненный фиксаторным раствором.ПРИМЕЧАНИЕ: Добавьте объем фиксативного решения, который в 20 раз больше, чем у образцов, чтобы обеспечить полную фиксацию. Выполните следующие процессы на nutator, если не указано иное. В целом, органоиды фиксируются с 4% параформальдегида (PFA) в PBS. Тем не менее, различные фиксаторы могут потребоваться для обнаружения конкретных белков. Например, мы использовали 4% PFA с 0,25% глутаралдегида в PBS для обнаружения F-актина и ацетилированного тубулина. Для обнаружения инсектина (ИТЛН) и ЗО-1 органоиды фиксируются раствором ледяного Дента (4:1 метанол: диметилсульфоксид) на ночь при -20 градусов по Цельсию. Фиксированные органоиды Дента должны быть серийно обезвожены перед стиркой (шаг 6.3). Длительность инкубации и мытья антител может быть оптимизирована для конкретных нужд. Исправить органоиды в течение 15 мин при комнатной температуре (RT) или на ночь при температуре 4 градусов по Цельсию. Вымойте 3 раза с PBST (PBS с 0,1% Тритон X-100) в течение 15 минут на RT. Блок неспецифической привязки с 10% козьей сыворотки в PBST (PBSGT) в течение 1 ч на RT. Инкубация с первичными антителами (1:200) в PBSGT ночь при 4 градусов по Цельсию. Вымойте 3 раза с PBST в течение 15 минут на RT. Инкубация вторичными антителами (1:200) в PBSGT ночь при 4 градусах Цельсия. Вымойте 3 раза с PBST в течение 15 минут на RT. Перенесите фиксированные и иммунотелированные органоиды в камеру визуализации и приступайте к конфокальные изображения.