We beschrijven een eenvoudig protocol voor de ontwikkeling van mucociliarie epitheelorganoïden uit diepe ectoderm cellen geïsoleerd van Xenopus laevis embryo’s. De multipotige voorlopers regenereren epitheel bekercelprecursoren en laten live tracking van de initiatie en progressie van de celovergangen op het oppervlak van organoïden toe.
Mucociliary epitheel biedt de eerste verdedigingslinie door het verwijderen van vreemde deeltjes door de werking van slijmproductie en cilia-gemedieerde klaring. Veel klinisch relevante gebreken in het mucociliary epitheel worden afgeleid als ze diep in het lichaam voorkomen. Hier introduceren we een kanseerbare 3D-model voor mucociliary epitheel gegenereerd door multipotente voorlopers die microchirurgisch geïsoleerd waren van Xenopus laevis embryo’s. De mucociliary epitheelorganoïden zijn bedekt met nieuw gegenereerd epitheel uit diepe ectoderm cellen en later versierd met verschillende patroon multiciliated cellen, secretoire cellen, en slijm-producerende bekercellen die niet te onderscheiden zijn van de inheemse opperhuid binnen 24 uur. De volledige sequenties van dynamische celovergangen van mesenchymale naar epitheliale die ontstaan op het apicale oppervlak van organoïden kunnen worden gevolgd door hoge resolutie live beeldvorming. Deze in vitro gekweekte, zelforganiserende mucociaire epitheel organoïden bieden duidelijke voordelen bij het bestuderen van de biologie van mucociënie epitheel met een hoog rendement in de generatie, gedefinieerde cultuuromstandigheden, controle over aantal en grootte, en directe toegang voor live beeldvorming tijdens de regeneratie van de gedifferentieerde epitheel.
Letsel, infectie, en ziekte van mucociliaire epitheel worden geassocieerd met verminderde productie en klaring van slijm die vaak wordt gevonden in longaandoeningen zoals chronische obstructieve longziekte, astma, cystische fibrose, bronchiectasis, en primaire ciliary dyskinesie1,2,3,4. Een recente vooruitgang in organoïde technologie, bijvoorbeeld, de basale cel afgeleide long organoïde genaamd tracheosfeer die recapituleert de regeneratie van mucocieleïteit epitheel ontstaan als een veelbelovend model met therapeutisch potentieel1,5,6. Het gebruik ervan is momenteel echter beperkt, deels door gebrek aan de gedefinieerde cultuuromstandigheden en de lage efficiëntie in organoïde producties. Mucociliary epitheel in de menselijke luchtwegen en kikker opperhuid zijn opmerkelijk vergelijkbaar in weefselmorfologie, cellulaire samenstelling, en de functie7,8,9,10,11,12. In beide organismen biedt mucociliary epitheel eerstelijnsverdediging door slijm en antimicrobiële stoffen te afscheiden en schadelijke deeltjes en ziekteverwekkers te wissen door de gesynchroniseerde werking van trilharen.
Hier beschrijven we een eenvoudig protocol om mucociliarie epitheelorganoïden te genereren met behulp van de multipotige voorlopers van Xenopus laevis embryo’s13,14. Eerder meldden we14 dat bij afwezigheid van exogene groeifactoren en de extracellulaire matrix, de microchirurgisch geïsoleerde diepe cellen uit het vroege gastrulastadium ectoderm spontaan assembleren in aggregaten, epitheel regenereren op het oppervlak en rijpen tot mucociliary epitheel door multiciliated en andere accessoirecellen binnen 24 uur te intercalating. Naast de snelle ontwikkeling biedt dit protocol een duidelijke mogelijkheid om rechtstreeks toegang te krijgen tot de overgangen van multipotente diepe ectodermcellen naar epitheelbletcelverervers die de regeneratiestappen van een verstoord epitheel14 samenvatten die niet beschikbaar zijn uit intacte embryo’s en ectoderm (ook bekend als de dierencap)15,16,17. Het aantal en de grootte van de geproduceerde organoïden zijn schaalbaar met een hoge efficiëntie door het controleren van de uitgangsmaterialen van Xenopus embryo’s. Organoïden in drijvende cultuur kunnen gemakkelijk worden gesorteerd en overgebracht in het gewenste stadium voor verdere analyses, waaronder hoge resolutie beeldvorming, mechanische testen, medicamenteuze behandeling en genetische karakterisering14. Deze spontane, weefselmechanica-gedreven regeneratie van het epitheel op het oppervlak van embryonale celaggregaten resulteert in mucociliary epitheel organoïden en bieden een nieuw driedimensionaal (3D) model om de biologie van het mucociliarie epitheel te bestuderen.
Mucociliary epitheelorganoïden gegenereerd uit diepe ectodermcellen van X. laevis embryo zijn een krachtig hulpmiddel om de epitheelialisatie en differentiatie van multipotende voorlopers in vitro te bestuderen. In tegenstelling tot de breed aangenomen pettest16 die wordt gebruikt voor in vitro organogenese13 en de ontwikkeling van mucociiliary epithelia15,17,22 die gebruik maken van de intacte ectoderm, bieden de in dit protocol gepresenteerde diep ectoderm-afgeleide organoïden een duidelijke kans om de weefselmechanica-aangedreven regeneratiefasen van het oppervlakteeppitheel14te controleren. Op ongeveer 2 hpa beginnen de nieuw gegenereerde ZO-1 positieve epitheelcellen (figuur 2) te verschijnen op het apicale oppervlak van organoïden en hun populatie te verhogen om de gehele organoïde te bedekken als het weefsel stollen of vermindert de naleving14. De regeneratie van het epitheel en de daaropvolgende afstammingsspecificaties voor slijmproducerende bekercellen gaan spontaan in een chemisch gedefinieerde kweekmedia binnen een dag. Deze zich snel ontwikkelende mucociaire epitheelorganoïden bieden een platform om dynamisch celgedrag in real-time, in hoge resolutie, te onderzoeken tijdens progressieve stappen van epitheliale regeneratie. Ze maken ook onderzoek mogelijk naar fundamentele vragen die zich voordoen tijdens de ontwikkeling van mucociërkunde epitheel, homeostase en bijbehorende ziekten2,9,23. In het bijzonder kan de mechanische gevoeligheid van de diepe voorlopercellen tijdens de overgang naar epitheliale bekercelprecursoren die in de organoïden14 zijn geïdentificeerd, dienen om ademhalingsziekten in verband met abnormale basale differentiatie te koppelen wanneer slijmafscheidende bekercellen over- of onderproductie zijn23.
Hoewel dit protocol een eenvoudige aanpak biedt om deze organoïden te genereren, zijn er verschillende kritieke stappen voor succes in experimenten. Om besmetting van oppervlakkige epitheelcellen tijdens de isolatie van diepe ectodermcellen van de dierlijke dop te voorkomen, moet men de dierendop in calcium- en magnesiumvrije DFA onder een stereoscoop controleren en het juiste moment detecteren om de scheiding van de donkergeigmenteerde oppervlakkige laag van de dierendop te starten. Als het weefsel te lang in calcium- en magnesiumvrije DFA wordt bewaard, zal het hele weefsel zich afscheiden en onderscheid maken tussen diepe en oppervlakkige cellen zou dan onmogelijk zijn voor diepe ectodermaggregaten. Om de afwezigheid van oppervlakkige cellen in diepe ectodermaggregaten te bevestigen, raden we aan fluorescerend het apicale oppervlak van het embryo te labelen met NHS-rhodamine (stap 1.414) voorafgaand aan microchirurgie; dit zou een gemakkelijke identificatie van oppervlaktecellen mogelijk maken als ze in de resulterende organoïden voorkomen. Aangezien epitheelregeneratie wordt gereguleerd door weefselmechanica14,is het essentieel om onbedoelde krachtgeneratie voor zelforganiserende organoïden te voorkomen. In het bijzonder raden we aan contact met de glazen bodem van de beeldkamer tijdens live beeldvorming te vermijden door aggregaten aan de randen van de TEM-rasters te plaatsen, omdat dit vrij contact met het beeldvenster van live aggregaten mogelijk maakt (stap 5.1.2.). Dit in vitro–gekweekte, zelfgeorganiseerde 3D-model voor mucociliary epitheel zal dienen als een aaneenbaar instrument om de fundamentele vragen die zich voordoen tijdens de regeneratie van epitheel en de afstamming specificatie van bekercellen te beantwoorden.
The authors have nothing to disclose.
Wij danken leden van Kim lab en Lance Davidson voor hun opmerkingen en steun. Dit werk werd ondersteund door Young Scientist Fellowship aan HYK van Institute for Basic Science (IBS-R0250Y1).
Equipment | |||
Dual-stage Glass Micropipette Puller | Narishige | PC-100 | |
Picoliter microinjector | Warner Instruments | PLI-100A | |
Confocal Laser Microscope | |||
Stereoscope | |||
Tools | |||
Forcep | Dumont | Dumont #5 | |
Hair knife | Reference (Kay, B.K.; Peng, H.B., 1991) | ||
Hair loop | Reference (Kay, B.K.; Peng, H.B., 1991) | ||
hCG injection | |||
human chorionic gonadotropin | Sigma | cg10-10vl | |
MBS solution | |||
10M Sodium hydroxide | Sigma | 72068 | |
Calcium chloride | Sigma | C3881 | |
Calcium nitrate | Sigma | C1396 | |
HEPES | Sigma | H4034 | |
Magnesium sulfate | Sigma | 230391 | |
Phenol-red | Sigma | P0290 | |
Potassium chloride | Sigma | 7447-40-7 | |
Sodium bicarbonate | Sigma | S6014 | |
Sodium chloride | Sigma | S9625 | |
Sodium hydroxide reagent grade, 97%, powder-25g | Sigma | 655104 | |
dejellying solution | |||
L-Cysteine hydrochloride monohydrate | Sigma | C7880 | |
Sodium hydroxide 10M | Sigma | 72068 | |
Ficoll solution | |||
Ficoll | Sigma | F4375 | |
DFA solution | |||
Sodium chloride | Sigma | S9625 | |
0.22mm Filter | Millipore | S2GPT05RE | |
Antibiotic Antimycotic Solution | Sigma | A5955 | |
Bicine | Sigma | B3876 | |
Calcium chloride | Sigma | C3881 | |
Magnesium sulfate | Sigma | 230391 | |
Potassium gluconate | Sigma | G4500 | |
Sodium carbonate | Sigma | 222321 | |
Sodium gluconate | Sigma | G9005 | |
mRNA in vitro transcription | |||
SP6/T7 in vitro transcription kit | Invitrogen | AM1340 | |
mRNA microinjection | |||
Borosilicate glass capillary tubes | Harvard Apparatus | GC100-10 | |
Eppendorf microloader pipette tips | ThermoFisher | A25547 | |
Mineral oil | Sigma | M5904 | |
PCR tube coating | |||
BSA | Thermofisher | 26140079 | |
PCR tubes | SSI | SSI-3245-00 | |
Imaging | |||
Custom-milled acrylic chamber | |||
Coverglass 24mmX50mm | Duran | B01_001650 | |
SPI Hexagonal TEM Grids, Gilded Nickel (50mesh) | SPI | 275HGN-XA | |
SPI Hexagonal TEM Grids, Gilded Nickel (75mesh) | SPI | 2775GN-XA | |
Silicone grease | Shinetsu | HIVAC-G | |
Fixation | |||
20ml screw top-cap vial | Wheaton | WH.986580 | |
2ml screw top-cap vial | |||
Benzyl alcohol | Sigma | 305197 | |
Benzyl benzoate | Sigma | B6630 | |
Dimethyl sulfoxide (DMSO) | Sgima | D4540 | |
Glutaraldehyde 10% EM GRADE | Electron Microscopy Sciences | 16120 | |
Goat serum | Jackson | 005-000-121 | |
Methanol | Sigma | 322415 | |
Paraforlamdehyde | Sigma | P6148 | |
Phosphate-buffered saline (PBS) | LPS Solution | CBP007B | |
Triton X-100 | Sigma | T8787 | |
Primary antibody (1:200) | |||
acetylated tubulin | Sigma | clone 6-11B-1 | |
Itln1 | Proteintech | 11770-1-AP | |
Keratin | Developmental Studies Hybridoma Bank | 1h5 | |
ZO1 | Invitrogen | 402200 | |
Vectors | |||
pCS2-mem-GFP | Gift from Dr. Lance Davidson | ||
pCS2-ZO1-RFP | Gift from Dr. Lance Davidson |