العضويات الظهارية المخاطية من الخلايا الجنينية زينوبوس: التوليد والثقافة والتصوير الحي عالي الدقة
Summary
نحن نصف بروتوكول بسيط لتطوير الظهارية المخاطية من الخلايا الأضمرمة العميقة المعزولة من الأجنة xenopus laevis. السلف متعددة القدرات تجديد السلائف خلية القروب الظهارية والسماح بالتتبع الحي لبدء وتطور انتقالات الخلية على سطح organoids.
Abstract
يوفر ظهارة مخاطية خط الدفاع الأول عن طريق إزالة الجسيمات الأجنبية من خلال عمل إنتاج المخاط وإزالة بوساطة أهديا. العديد من العيوب ذات الصلة سريريا في ظهارة المخاطية هي الاستدلال لأنها تحدث في عمق الجسم. هنا، نقدم نموذج 3D قابل للغشاء المخاطي ظهارة ولدت من السلفارع متعددة القدرات التي كانت معزولة microsurgically من الأجنة xenopus laevis. وتغطي الظهارية المخاطية مع الظهارة التي تم إنشاؤها حديثا من خلايا البشرة العميقة وزينت في وقت لاحق مع خلايا متعددة الciliat منقوشة متميزة, الخلايا الإفرازية, والخلايا القبل المنتجة للمخاط التي لا يمكن تمييزها من البشرة الأصلية في غضون 24 ساعة. يمكن تتبع التسلسلات الكاملة لانتقالات الخلايا الديناميكية من الظهارية الظهارية إلى الظهارة التي تظهر على السطح العضلي من العضيات بواسطة التصوير الحي عالي الدقة. هذه في المختبر مثقف، عصامي التنظيم المخاطية تقدم مزايا متميزة في دراسة بيولوجيا ظهارة المخاطية مع كفاءة عالية في توليد، ظروف الثقافة المحددة، والسيطرة على عدد وحجم، والوصول المباشر للتصوير الحي أثناء تجديد ظهارة متمايزة.
Introduction
ترتبط الإصابة والعدوى ومرض ظهارة المخاطية بضعف إنتاج وإزالة المخاط الذي غالبا ما توجد في الاضطرابات الرئوية مثل مرض الانسداد الرئوي المزمن والربو والتليف الكيسي والتهاب القصبات الهوائية وخلل التوازن الهدبي الأولي1،2،3،4. وهناك تقدم في الآونة الأخيرة في التكنولوجيا العضوية، على سبيل المثال، الخلية القاعدية المشتقة من اعضوية الرئة دعا القصبة الهوائية التي تتلخص في تجديد ظهارة mucociliary تنشأ كنموذج واعد مع إمكانات علاجية1،5،6. غير أن استخدامه محدود حالياً، ويرجع ذلك جزئياً إلى الافتقار إلى ظروف الثقافة المحددة وانخفاض الكفاءة في الإنتاج العضوي. الظهارة المخاطية في مجرى الهواء البشري والضفدع البشرة متشابهة بشكل ملحوظ في تكوين الأنسجة، وتكوين الخلايا، ووظيفتها7،8،9،10،11،12. في كلا الكائنين، يوفر الظهارة المخاطية الدفاع الخط الأول عن طريق إفراز المخاط والمواد المضادة للميكروبات ومسح الجسيمات الضارة ومسببات الأمراض من خلال العمل المتزامن من أهداب.
هنا، ونحن وصف بروتوكول بسيط لتوليد organoids الظهارية المخاطية باستخدام النسل متعددة القدرات من الأجنة xenopus laevis 13،14. سابقا، أبلغنا14 أنه في غياب عوامل النمو الخارجية والمصفوفة خارج الخلية، والخلايا العميقة المعزولة المجهرية من مرحلة gastrula في وقت مبكر التجميع التلقائي في المجاميع، وتجديد الظهارة على سطحها، وتنضج في ظهارة المخاطية عن طريق intercalated multiciliated وخلايا أخرى ملحقة داخل 24 ح. بالإضافة إلى التطور السريع، وهذا البروتوكول يوفر فرصة متميزة للوصول مباشرة إلى انتقالات الخلايا الكلية العميقة متعددة القدرات إلى ذريات خلية القروبة الظهارية التي تتجدد خطوات تجديدظهارة 14 المعطلة التي لا تتوفر من الأجنة سليمة و ectoderm (المعروف أيضا باسم قبعة الحيوان)15،16،17. عدد وحجم organoids المنتجة قابلة للتطوير مع كفاءة عالية من خلال السيطرة على المواد بدءا من أجنة Xenopus. يمكن فرز العضيات في الثقافة العائمة بسهولة ونقلها في المرحلة المطلوبة لإجراء المزيد من التحليلات ، بما في ذلك التصوير عالي الدقة ، والاختبار الميكانيكي ، والعلاج من المخدرات ، والتوصيف الجيني14. هذا التجديد التلقائي الذي يحركه ميكانيكا الأنسجة للظهارة على سطح مجاميع الخلايا الجنينية ينتج عنه ظهارة ظهارية مُخاطية ويوفر نموذجًا ثلاثي الأبعاد جديدًا (ثلاثي الأبعاد) لدراسة بيولوجيا الظهارة المخاطية.
Protocol
Representative Results
Discussion
الظهارة الظهارية المخاطية ولدت من الخلايا الدهنية العميقة من الجنين x. laevis هي أداة قوية لدراسة الظهارة والتمايز من السلفات متعددة القدرات في المختبر. على النقيض من اعتمادها على نطاق واسع الحيوان16 قبعة المقايسة المستخدمة في الجهاز في المختبر13 وتطوير الظهارية المخاطية15,17,22 التي تستخدم ectoderm سليمة, العضويات العميقة المشتقة من الأكتودر المقدمة في هذا البروتوكول توفر فرصة متميزة لرصد مراحل تجديد الأنسجة التي تحركها الميكانيكا من الظهارة السطحية14. في حوالي 2 حصانا، ولدت حديثا ZO-1 الخلايا الظهارية الإيجابية(الشكل 2)تبدأ في الظهور على سطح apical من organoids وزيادة عدد سكانها لتغطية الجهاز بأكمله كما يوطد الأنسجة أو يقلل من الامتثال14. تجديد الظهارة ومواصفات النسب اللاحقة للخلايا القبل المنتجة للمخاط تسير تلقائيا في وسائل الإعلام الثقافة المحددة كيميائيا في غضون يوم واحد. هذه العضوية الظهارية المخاطية النامية بسرعة توفر منصة لدراسة سلوكيات الخلايا الديناميكية في الوقت الحقيقي ، في دقة عالية ، خلال الخطوات التقدمية للتجديد الظهاري. كما أنها تمكن من التحقيق في الأسئلة الأساسية التي تنشأ خلال تطوير ظهارة المخاطية ، وداء التوازن ، والأمراض المرتبطة بها2،9،23. على وجه الخصوص، قد الحساسية الميكانيكية للخلايا السلف العميقة خلال الانتقال إلى سلائف خلية القبل الظهارية المحددة في organoids14 يمكن أن تعمل على ربط أمراض الجهاز التنفسي المرتبطة بالتمايز القاعدي غير الطبيعي حيث تكون خلايا القبل المخاطية السرية فوق أو تحت الإنتاج23.
في حين أن هذا البروتوكول يوفر نهجا بسيطا لتوليد هذه organoids ، وهناك عدة خطوات حاسمة للنجاح في التجارب. لمنع تلوث الخلايا الظهارية السطحية أثناء عزل الخلايا الظهارية العميقة من غطاء الحيوان ، يجب على المرء مراقبة الغطاء الحيواني الموضوع في DFA خالية من الكالسيوم والمغنيسيوم تحت منظار مجسم والكشف عن الوقت المناسب لبدء فصل الطبقة السطحية الداكنة المصطبغة من غطاء الحيوان. إذا تم الاحتفاظ الأنسجة في الكالسيوم والمغنيسيوم خالية من DFA لفترة طويلة جدا، فإن الأنسجة بأكملها تتفكك والتمييز بين الخلايا العميقة والسطحية ثم سيكون من المستحيل للمجاميع الأكتودر العميق. لتأكيد عدم وجود خلايا سطحية في مجاميع الأوكسيد العميقة ، نوصي بوضع علامة فلورية على السطح الزفي للجنين مع NHS-rhodamine (الخطوة 1.414)قبل الجراحة الدقيقة ؛ وهذا من شأنه أن يسمح لتحديد سهلة من الخلايا السطحية إذا كانت موجودة في organoids الناتجة. منذ يتم تنظيم التجديد الظهاري من قبل ميكانيكا الأنسجة14، فمن الضروري تجنب توليد القوة غير المقصودة للتنظيم الذاتي organoids. على وجه الخصوص، نقترح تجنب الاتصال مع القاع الزجاجي لغرفة التصوير أثناء التصوير الحي عن طريق وضع المجاميع على حواف شبكات TEM لأن هذا يسمح بالاتصال المجاني مع نافذة التصوير للمجاميع الحية (الخطوة 5.1.2.). هذا في المختبر–مثقف، نموذج 3D منظم ذاتيا لظهارة mucociliary ستكون بمثابة أداة قابلة للاسترجاع للإجابة على الأسئلة الأساسية التي تنشأ أثناء تجديد ظهارة ومواصفات النسب من الخلايا القبل.
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
نشكر أعضاء مختبر كيم ولانس ديفيدسون على تعليقاتهم ودعمهم. وقد دعم هذا العمل من قبل زمالة العلماء الشباب إلى HYK من معهد العلوم الأساسية (IBS-R0250Y1).
Materials
| Equipment | |||
| Dual-stage Glass Micropipette Puller | Narishige | PC-100 | |
| Picoliter microinjector | Warner Instruments | PLI-100A | |
| Confocal Laser Microscope | |||
| Stereoscope | |||
| Tools | |||
| Forcep | Dumont | Dumont #5 | |
| Hair knife | Reference (Kay, B.K.; Peng, H.B., 1991) | ||
| Hair loop | Reference (Kay, B.K.; Peng, H.B., 1991) | ||
| hCG injection | |||
| human chorionic gonadotropin | Sigma | cg10-10vl | |
| MBS solution | |||
| 10M Sodium hydroxide | Sigma | 72068 | |
| Calcium chloride | Sigma | C3881 | |
| Calcium nitrate | Sigma | C1396 | |
| HEPES | Sigma | H4034 | |
| Magnesium sulfate | Sigma | 230391 | |
| Phenol-red | Sigma | P0290 | |
| Potassium chloride | Sigma | 7447-40-7 | |
| Sodium bicarbonate | Sigma | S6014 | |
| Sodium chloride | Sigma | S9625 | |
| Sodium hydroxide reagent grade, 97%, powder-25g | Sigma | 655104 | |
| dejellying solution | |||
| L-Cysteine hydrochloride monohydrate | Sigma | C7880 | |
| Sodium hydroxide 10M | Sigma | 72068 | |
| Ficoll solution | |||
| Ficoll | Sigma | F4375 | |
| DFA solution | |||
| Sodium chloride | Sigma | S9625 | |
| 0.22mm Filter | Millipore | S2GPT05RE | |
| Antibiotic Antimycotic Solution | Sigma | A5955 | |
| Bicine | Sigma | B3876 | |
| Calcium chloride | Sigma | C3881 | |
| Magnesium sulfate | Sigma | 230391 | |
| Potassium gluconate | Sigma | G4500 | |
| Sodium carbonate | Sigma | 222321 | |
| Sodium gluconate | Sigma | G9005 | |
| mRNA in vitro transcription | |||
| SP6/T7 in vitro transcription kit | Invitrogen | AM1340 | |
| mRNA microinjection | |||
| Borosilicate glass capillary tubes | Harvard Apparatus | GC100-10 | |
| Eppendorf microloader pipette tips | ThermoFisher | A25547 | |
| Mineral oil | Sigma | M5904 | |
| PCR tube coating | |||
| BSA | Thermofisher | 26140079 | |
| PCR tubes | SSI | SSI-3245-00 | |
| Imaging | |||
| Custom-milled acrylic chamber | |||
| Coverglass 24mmX50mm | Duran | B01_001650 | |
| SPI Hexagonal TEM Grids, Gilded Nickel (50mesh) | SPI | 275HGN-XA | |
| SPI Hexagonal TEM Grids, Gilded Nickel (75mesh) | SPI | 2775GN-XA | |
| Silicone grease | Shinetsu | HIVAC-G | |
| Fixation | |||
| 20ml screw top-cap vial | Wheaton | WH.986580 | |
| 2ml screw top-cap vial | |||
| Benzyl alcohol | Sigma | 305197 | |
| Benzyl benzoate | Sigma | B6630 | |
| Dimethyl sulfoxide (DMSO) | Sgima | D4540 | |
| Glutaraldehyde 10% EM GRADE | Electron Microscopy Sciences | 16120 | |
| Goat serum | Jackson | 005-000-121 | |
| Methanol | Sigma | 322415 | |
| Paraforlamdehyde | Sigma | P6148 | |
| Phosphate-buffered saline (PBS) | LPS Solution | CBP007B | |
| Triton X-100 | Sigma | T8787 | |
| Primary antibody (1:200) | |||
| acetylated tubulin | Sigma | clone 6-11B-1 | |
| Itln1 | Proteintech | 11770-1-AP | |
| Keratin | Developmental Studies Hybridoma Bank | 1h5 | |
| ZO1 | Invitrogen | 402200 | |
| Vectors | |||
| pCS2-mem-GFP | Gift from Dr. Lance Davidson | ||
| pCS2-ZO1-RFP | Gift from Dr. Lance Davidson |
References
- Barkauskas, C. E., et al. Lung organoids: current uses and future promise. Development. 144 (6), 986-997 (2017).
- Puchelle, E., Zahm, J. M., Tournier, J. M., Coraux, C. Airway Epithelial Repair, Regeneration, and Remodeling after Injury in Chronic Obstructive Pulmonary Disease. Proceedings of the American Thoracic Society. 3 (8), 726-733 (2006).
- Tilley, A. E., Walters, M. S., Shaykhiev, R., Crystal, R. G. Cilia dysfunction in lung disease. Annual Review of Physiology. 77, 379-406 (2015).
- Vareille, M., Kieninger, E., Edwards, M. R., Regamey, N. The Airway Epithelium: Soldier in the Fight against Respiratory Viruses. Clinical Microbiology Reviews. 24 (1), 210-229 (2011).
- Rock, J. R., et al. Basal cells as stem cells of the mouse trachea and human airway epithelium. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 106 (31), 12771-12775 (2009).
- Sachs, N., et al. Long-term expanding human airway organoids for disease modeling. The EMBO Journal. 38 (4), 100300 (2019).
- Dubaissi, E., et al. A secretory cell type develops alongside multiciliated cells, ionocytes and goblet cells, and provides a protective, anti-infective function in the frog embryonic mucociliary epidermis. Development. 141 (7), 1514-1525 (2014).
- Hayes, J. M., et al. Identification of novel ciliogenesis factors using a new in vivo model for mucociliary epithelial development. Developmental Biology. 312 (1), 115-130 (2007).
- Walentek, P., Quigley, I. K. What we can learn from a tadpole about ciliopathies and airway diseases: Using systems biology in Xenopus to study cilia and mucociliary epithelia. Genesis. 55 (1-2), (2017).
- Werner, M. E., Mitchell, B. J. Understanding ciliated epithelia: The power of Xenopus. Genesis. 50 (3), 176-185 (2012).
- Dubaissi, E., Papalopulu, N. Embryonic frog epidermis: a model for the study of cell-cell interactions in the development of mucociliary disease. Disease Models & Mechanisms. 4 (2), 179-192 (2011).
- Walentek, P., et al. A novel serotonin-secreting cell type regulates ciliary motility in the mucociliary epidermis of Xenopus tadpoles. Development. 141 (7), 1526-1533 (2014).
- Asashima, M., et al. In vitro organogenesis from undifferentiated cells in Xenopus. Developmental Dynamics. 238 (6), 1309-1320 (2009).
- Kim, H. Y., Jackson, T. R., Stuckenholz, C., Davidson, L. A. Tissue mechanics drives regeneration of a mucociliated epidermis on the surface of Xenopus embryonic aggregates. Nature Communications. 11 (1), 665 (2020).
- Haas, M., et al. DeltaN-Tp63 Mediates Wnt/beta-Catenin-Induced Inhibition of Differentiation in Basal Stem Cells of Mucociliary Epithelia. Cell Reports. 28 (13), 3338-3352 (2019).
- Green, J., Guille, M. . Molecular Methods in Developmental Biology: Xenopus and Zebrafish. , 1-13 (1999).
- Stubbs, J. L., Davidson, L., Keller, R., Kintner, C. Radial intercalation of ciliated cells during Xenopus skin development. Development. 133 (13), 2507-2515 (2006).
- Nieuwkoop, P. D., Faber, J. . Normal table of Xenopus laevis (Daudin) : a systematical and chronological survey of the development from the fertilized egg till the end of metamorphosis. , (1994).
- Sive, H. L., Grainger, R. M., Harland, R. M. . Early development of Xenopus laevis : a laboratory manual. , (2000).
- Joshi, S. D., Kim, H. Y., Davidson, L. A. Microscopy tools for quantifying developmental dynamics in Xenopus embryos. Methods in Molecular Biology. 917, 477-493 (2012).
- Sater, A. K., Steinhardt, R. A., Keller, R. Induction of neuronal differentiation by planar signals in Xenopus embryos. Developmental Dynamics. 197 (4), 268-280 (1993).
- Sedzinski, J., Hannezo, E., Tu, F., Biro, M., Wallingford, J. B. Emergence of an Apical Epithelial Cell Surface In Vivo. Developmental Cell. 36 (1), 24-35 (2016).
- Rock, J. R., Randell, S. H., Hogan, B. L. M. Airway basal stem cells: a perspective on their roles in epithelial homeostasis and remodeling. Disease Models & Mechanisms. 3 (9-10), 545-556 (2010).
