Kenopus Embriyonik Hücrelerden Mukosiyaliyer Epitel Organoidler: Nesil, Kültür ve Yüksek Çözünürlüklü Canlı Görüntüleme
Summary
Xenopus laevis embriyolarından izole edilmiş derin ektoderm hücrelerinden mukozisel epitel organoidleri geliştirmek için basit bir protokol uyguluyoruz. Çok güçlü atalar epitel goblet hücre öncüllerini yeniler ler ve organoidlerin yüzeyinde hücre geçişlerinin başlatılmasıve ilerlemesinicanlı olarak izlemesağlarlar.
Abstract
Mukoza epitel, mukus üretimi ve silia aracılı açıklık hareketi ile yabancı parçacıkları nisbeten kaldırarak ilk savunma hattını sağlar. Mukozial epiteldeki klinik olarak alakalı birçok kusur, vücudun derinliklerinde meydana geldiği için çıkarılır. Burada, Xenopus laevis embriyolarından mikrocerrahi olarak izole edilen çok güçlü atalardan üretilen mukozier epitel için çekilebilir bir 3D model sokulmuş. Mukozaepiteler organoidler derin ektoderm hücrelerinden yeni üretilen epitel ile kaplıdır ve daha sonra farklı desenli çok katlı hücreler ile dekore edilmiştir, salgı hücreleri, ve mukus üreten goblet hücreleri içinde yerli epidermis ayırt edilemez 24 saat. Organoidlerin apikal yüzeyinde ortaya çıkan mezenkimalden epitele dinamik hücre geçişlerinin tam dizileri yüksek çözünürlüklü canlı görüntüleme ile izlenebilir. Bu in vitro kültürlü, kendi kendini organize mucociliary epitel organoidler nesil yüksek verimlilik ile mucociliary epitel biyolojisi çalışmada farklı avantajlar sunuyoruz, tanımlanmış kültür koşulları, sayı ve boyut üzerinde kontrol, ve farklılaştırılmış epitel rejenerasyon sırasında canlı görüntüleme için doğrudan erişim.
Introduction
Yaralanma, enfeksiyon ve mukoza epitel hastalığı genellikle kronik obstrüktif akciğer hastalığı, astım, kistik fibrozis, bronşektazi ve primer siliyer diskinezi1,2,3,4gibi pulmoner bozukluklarda bulunan mukus üretimi ve temizliği ile ilişkilidir. Organoid teknolojide yeni bir ilerleme, örneğin, bazal hücre türetilmiş akciğer organoid trakeosfer denilen bu mucociliary epitel rejenerasyon recapitulates tedavi potansiyeli ile umut verici bir model olarak ortaya çıkar1,5,6. Ancak, kısmen tanımlanmış kültür koşullarının eksikliği ve organoid üretimlerde düşük verimlilik nedeniyle kullanımı şu anda sınırlıdır. Insan hava yolu ve kurbağa epidermisinde mukosiyabil epitel doku morfolojisi, hücresel bileşim ve işlevi7,8,9,10,11,12olarak oldukça benzerdir. Her iki organizmada da mukoza epiteli mukus ve antimikrobiyal maddeler salgılayarak birinci basamak savunma sağlar ve cilianın senkronize eylemi ile zararlı parçacıkları ve patojenleri temizler.
Burada, Xenopus laevis embriyolarının çok güçlü atalarını kullanarak mücociliary epitel organoidler oluşturmak için basit bir protokol açıklar13,14. Daha önce,14 ekzojen büyüme faktörleri ve ekstrasellüler matriks yokluğunda, mikrocerrahi erken gastrula evre ektoderm gelen derin hücreler izole kendiliğinden agregalar halinde biraraya, yüzeyinde epitel rejenere, ve mukozi epitel içine olgun içinde çok sayıdave diğer aksesuar hücreleri 24 saat içinde kenetlenme. Hızlı gelişime ek olarak, bu protokol, bozulmamış embriyolar ve ektoderm (ayrıca hayvan kapağı olarak da bilinir)15,16,17. Üretilen organoidlerin sayısı ve büyüklüğü Xenopus embriyolarından başlangıç malzemeleri kontrol edilerek yüksek verimlilikle ölçeklenebilir. Yüzen kültürde organoidler kolayca sıralanabilir ve yüksek çözünürlüklü görüntüleme, mekanik test, ilaç tedavisi ve genetik karakterizasyon14dahil olmak üzere daha fazla analiz için istenilen aşamada transfer edilebilir. Embriyonik hücre agregalarının yüzeyinde epitelin bu spontan, doku mekaniği güdümlü rejenerasyonu mukoziyal epitel organoidleri ile sonuçlanır ve mucociliary epitelin biyolojisini incelemek için üç boyutlu (3D) yeni bir model sağlar.
Protocol
Representative Results
Discussion
X. laevis embriyonun derin ektoderm hücrelerinden üretilen mucociliary epitel organoidler, çok güçlü ataların in vitro epitelizasyonunu ve farklılaşmasını incelemek için güçlü bir araçtır. Yaygın olarak benimsenen hayvan kapağı test16 in vitro organogenez13 ve mücociliary epitel gelişimi aksine15,17,22 bozulmamış ektoderm kullanan, bu protokolde sunulan derin ektoderm kaynaklı organoidler yüzey epitel 14 doku mekaniği odaklı rejenerasyon aşamaları izlemek için ayrı bir fırsat sunuyoruz14. Yaklaşık olarak 2 hpa, yeni oluşturulan ZO-1 pozitif epitel hücreleri(Şekil 2) organoidlerin apikal yüzeyinde görünmeye başlar ve doku katılaştırmak veya uyumu azaltır gibi tüm organoid kapsayacak şekilde popülasyonunu artırmak14. Mukus üreten goblet hücreleri için epitelin yenilenmesi ve sonraki soy özellikleri bir gün içinde kimyasal olarak tanımlanmış bir kültür medyasında kendiliğinden ilerler. Bu hızla gelişen mukozier epitel organoidler epitel rejenerasyon ilerici adımlar sırasında, gerçek zamanlı olarak dinamik hücre davranışlarını incelemek için bir platform sağlar. Ayrıca mucociliary epitel gelişimi sırasında ortaya çıkan temel soruların araştırılmasını sağlamak, homeostaz, ve ilişkili hastalıklar2,9,23. Özellikle, organoidler tespit epitel goblet hücre öncüleri geçiş sırasında derin progenitor hücrelerinmekanik duyarlılık14 mukus salgılayan goblet hücreleri üzerinde olduğu anormal bazal diferansiyasyon ile ilişkili solunum hastalıkları bağlamak için hizmet edebilir- veya az üretilen23.
Bu protokol bu organoidler oluşturmak için basit bir yaklaşım sunarken, deneylerde başarı için birkaç kritik adım vardır. Derin ektoderm hücrelerinin hayvan başlığından izole edilmesi sırasında yüzeysel epitel hücrelerinin kirlenmesini önlemek için, kalsiyum ve magnezyumsuz DFA’ya yerleştirilen hayvan kapağını stereoskop altında izlemeli ve hayvan kapağının koyu pigmentli yüzeysel tabakasının ayrılığını başlatmak için doğru zamanı saptamalıdır. Doku kalsiyum ve magnezyum içermeyen DFA çok uzun süre tutulursa, tüm doku ayrışacak ve derin ve yüzeysel hücreler arasında ayrım daha sonra derin ektoderm agregalar için imkansız olacaktır. Derin ektoderm agregalarında yüzeysel hücrelerin yokluğunu doğrulamak için, mikrocerrahiden önce embriyonun apikal yüzeyini NHS-rhodamine (adım 1.414)ile floresan olarak etiketlemenizi öneririz; ortaya çıkan organoidler varsa bu yüzey hücrelerinin kolayca tanımlanması için izin verecek. Epitel rejenerasyon doku mekaniği tarafından düzenlenir beri14, kendi kendini organize organoidler için istenmeyen kuvvet oluşumunu önlemek için esastır. Özellikle canlı agregaların görüntüleme penceresi ile ücretsiz temas sağladığından TEM ızgaralarının kenarlarına agregalar yerleştirerek canlı görüntüleme sırasında görüntüleme odasının cam alt kısmıyla temastan kaçınmanızı öneririz (adım 5.1.2.). Bu in vitro–mucociliary epitel için kültürlü, kendi kendine organize 3D model epitel rejenerasyon ve goblet hücrelerinin soy özellikleri sırasında ortaya çıkan temel soruları cevaplamak için bir çekilebilir araç olarak hizmet edecektir.
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Biz yorum ve destek için Kim laboratuvar ve Lance Davidson üyelerine teşekkür ederiz. Bu çalışma, Genç Bilim Adamı Bursu ile HYK’a Temel Bilimler Enstitüsü’nden (IBS-R0250Y1) desteklenmiştir.
Materials
| Equipment | |||
| Dual-stage Glass Micropipette Puller | Narishige | PC-100 | |
| Picoliter microinjector | Warner Instruments | PLI-100A | |
| Confocal Laser Microscope | |||
| Stereoscope | |||
| Tools | |||
| Forcep | Dumont | Dumont #5 | |
| Hair knife | Reference (Kay, B.K.; Peng, H.B., 1991) | ||
| Hair loop | Reference (Kay, B.K.; Peng, H.B., 1991) | ||
| hCG injection | |||
| human chorionic gonadotropin | Sigma | cg10-10vl | |
| MBS solution | |||
| 10M Sodium hydroxide | Sigma | 72068 | |
| Calcium chloride | Sigma | C3881 | |
| Calcium nitrate | Sigma | C1396 | |
| HEPES | Sigma | H4034 | |
| Magnesium sulfate | Sigma | 230391 | |
| Phenol-red | Sigma | P0290 | |
| Potassium chloride | Sigma | 7447-40-7 | |
| Sodium bicarbonate | Sigma | S6014 | |
| Sodium chloride | Sigma | S9625 | |
| Sodium hydroxide reagent grade, 97%, powder-25g | Sigma | 655104 | |
| dejellying solution | |||
| L-Cysteine hydrochloride monohydrate | Sigma | C7880 | |
| Sodium hydroxide 10M | Sigma | 72068 | |
| Ficoll solution | |||
| Ficoll | Sigma | F4375 | |
| DFA solution | |||
| Sodium chloride | Sigma | S9625 | |
| 0.22mm Filter | Millipore | S2GPT05RE | |
| Antibiotic Antimycotic Solution | Sigma | A5955 | |
| Bicine | Sigma | B3876 | |
| Calcium chloride | Sigma | C3881 | |
| Magnesium sulfate | Sigma | 230391 | |
| Potassium gluconate | Sigma | G4500 | |
| Sodium carbonate | Sigma | 222321 | |
| Sodium gluconate | Sigma | G9005 | |
| mRNA in vitro transcription | |||
| SP6/T7 in vitro transcription kit | Invitrogen | AM1340 | |
| mRNA microinjection | |||
| Borosilicate glass capillary tubes | Harvard Apparatus | GC100-10 | |
| Eppendorf microloader pipette tips | ThermoFisher | A25547 | |
| Mineral oil | Sigma | M5904 | |
| PCR tube coating | |||
| BSA | Thermofisher | 26140079 | |
| PCR tubes | SSI | SSI-3245-00 | |
| Imaging | |||
| Custom-milled acrylic chamber | |||
| Coverglass 24mmX50mm | Duran | B01_001650 | |
| SPI Hexagonal TEM Grids, Gilded Nickel (50mesh) | SPI | 275HGN-XA | |
| SPI Hexagonal TEM Grids, Gilded Nickel (75mesh) | SPI | 2775GN-XA | |
| Silicone grease | Shinetsu | HIVAC-G | |
| Fixation | |||
| 20ml screw top-cap vial | Wheaton | WH.986580 | |
| 2ml screw top-cap vial | |||
| Benzyl alcohol | Sigma | 305197 | |
| Benzyl benzoate | Sigma | B6630 | |
| Dimethyl sulfoxide (DMSO) | Sgima | D4540 | |
| Glutaraldehyde 10% EM GRADE | Electron Microscopy Sciences | 16120 | |
| Goat serum | Jackson | 005-000-121 | |
| Methanol | Sigma | 322415 | |
| Paraforlamdehyde | Sigma | P6148 | |
| Phosphate-buffered saline (PBS) | LPS Solution | CBP007B | |
| Triton X-100 | Sigma | T8787 | |
| Primary antibody (1:200) | |||
| acetylated tubulin | Sigma | clone 6-11B-1 | |
| Itln1 | Proteintech | 11770-1-AP | |
| Keratin | Developmental Studies Hybridoma Bank | 1h5 | |
| ZO1 | Invitrogen | 402200 | |
| Vectors | |||
| pCS2-mem-GFP | Gift from Dr. Lance Davidson | ||
| pCS2-ZO1-RFP | Gift from Dr. Lance Davidson |
References
- Barkauskas, C. E., et al. Lung organoids: current uses and future promise. Development. 144 (6), 986-997 (2017).
- Puchelle, E., Zahm, J. M., Tournier, J. M., Coraux, C. Airway Epithelial Repair, Regeneration, and Remodeling after Injury in Chronic Obstructive Pulmonary Disease. Proceedings of the American Thoracic Society. 3 (8), 726-733 (2006).
- Tilley, A. E., Walters, M. S., Shaykhiev, R., Crystal, R. G. Cilia dysfunction in lung disease. Annual Review of Physiology. 77, 379-406 (2015).
- Vareille, M., Kieninger, E., Edwards, M. R., Regamey, N. The Airway Epithelium: Soldier in the Fight against Respiratory Viruses. Clinical Microbiology Reviews. 24 (1), 210-229 (2011).
- Rock, J. R., et al. Basal cells as stem cells of the mouse trachea and human airway epithelium. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 106 (31), 12771-12775 (2009).
- Sachs, N., et al. Long-term expanding human airway organoids for disease modeling. The EMBO Journal. 38 (4), 100300 (2019).
- Dubaissi, E., et al. A secretory cell type develops alongside multiciliated cells, ionocytes and goblet cells, and provides a protective, anti-infective function in the frog embryonic mucociliary epidermis. Development. 141 (7), 1514-1525 (2014).
- Hayes, J. M., et al. Identification of novel ciliogenesis factors using a new in vivo model for mucociliary epithelial development. Developmental Biology. 312 (1), 115-130 (2007).
- Walentek, P., Quigley, I. K. What we can learn from a tadpole about ciliopathies and airway diseases: Using systems biology in Xenopus to study cilia and mucociliary epithelia. Genesis. 55 (1-2), (2017).
- Werner, M. E., Mitchell, B. J. Understanding ciliated epithelia: The power of Xenopus. Genesis. 50 (3), 176-185 (2012).
- Dubaissi, E., Papalopulu, N. Embryonic frog epidermis: a model for the study of cell-cell interactions in the development of mucociliary disease. Disease Models & Mechanisms. 4 (2), 179-192 (2011).
- Walentek, P., et al. A novel serotonin-secreting cell type regulates ciliary motility in the mucociliary epidermis of Xenopus tadpoles. Development. 141 (7), 1526-1533 (2014).
- Asashima, M., et al. In vitro organogenesis from undifferentiated cells in Xenopus. Developmental Dynamics. 238 (6), 1309-1320 (2009).
- Kim, H. Y., Jackson, T. R., Stuckenholz, C., Davidson, L. A. Tissue mechanics drives regeneration of a mucociliated epidermis on the surface of Xenopus embryonic aggregates. Nature Communications. 11 (1), 665 (2020).
- Haas, M., et al. DeltaN-Tp63 Mediates Wnt/beta-Catenin-Induced Inhibition of Differentiation in Basal Stem Cells of Mucociliary Epithelia. Cell Reports. 28 (13), 3338-3352 (2019).
- Green, J., Guille, M. . Molecular Methods in Developmental Biology: Xenopus and Zebrafish. , 1-13 (1999).
- Stubbs, J. L., Davidson, L., Keller, R., Kintner, C. Radial intercalation of ciliated cells during Xenopus skin development. Development. 133 (13), 2507-2515 (2006).
- Nieuwkoop, P. D., Faber, J. . Normal table of Xenopus laevis (Daudin) : a systematical and chronological survey of the development from the fertilized egg till the end of metamorphosis. , (1994).
- Sive, H. L., Grainger, R. M., Harland, R. M. . Early development of Xenopus laevis : a laboratory manual. , (2000).
- Joshi, S. D., Kim, H. Y., Davidson, L. A. Microscopy tools for quantifying developmental dynamics in Xenopus embryos. Methods in Molecular Biology. 917, 477-493 (2012).
- Sater, A. K., Steinhardt, R. A., Keller, R. Induction of neuronal differentiation by planar signals in Xenopus embryos. Developmental Dynamics. 197 (4), 268-280 (1993).
- Sedzinski, J., Hannezo, E., Tu, F., Biro, M., Wallingford, J. B. Emergence of an Apical Epithelial Cell Surface In Vivo. Developmental Cell. 36 (1), 24-35 (2016).
- Rock, J. R., Randell, S. H., Hogan, B. L. M. Airway basal stem cells: a perspective on their roles in epithelial homeostasis and remodeling. Disease Models & Mechanisms. 3 (9-10), 545-556 (2010).
